β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖工艺开发及交联酶聚体的制备

【摘要】：本文以商业β-半乳糖苷酶为对象，研究了其工业应用制备低聚半乳糖（GOS）的工艺过程，以及β-半乳糖苷酶交联酶聚体（CLEAs）的制备方法。为了提高GOS的产率，开发了酶解过程中添加金属离子和硼酸钠的新工艺；为解决β-半乳糖苷酶的回收再利用问题，开发了CLEAs的制备工艺，并针对传统CLEAs回用时高速离心导致部分酶失活且能耗高的缺陷，优化获得了β-半乳糖苷酶磁性CLEAs的制备新工艺。本文主要研究结论如下： β-半乳糖苷酶制备GOS工艺条件： pH=8，37℃，400g/L乳糖浓度，酶加入量25μL/g（酶/乳糖），反应2h，乳糖转化率为60.28%，GOS生成浓度为58.22g/L，GOS产率为14.56%。 离子对β-半乳糖苷酶酶活的影响及应用：浓度低于1mol/L的一价离子（K+、NH4+、Na+）中除Na+对水解活性无影响外，其余离子对β-半乳糖苷酶转糖苷活性和水解活性均具有激活作用；浓度高于1mol/L的一价离子抑制β-半乳糖苷酶酶活，且为可逆失活。在离子存在时，制备GOS的理想工艺条件为：37℃、pH=8的Tris-HCl缓冲液、0.08mol/L KCl，初始乳糖浓度500g/L，加酶量10μL/g乳糖，反应5h，乳糖转化率为65.14%，GOS浓度达到94.74g/L，GOS收率为23.69%，与未加金属离子的体系对比，乳糖转化率提高8.06%，GOS收率提高62.71%。 硼酸钠对制备GOS的影响：利用硼酸钠中Na+能够提高β-半乳糖苷酶的转糖苷活性，硼酸可以络合葡萄糖和半乳糖提高乳糖酶解率的特性，在制备GOS过程中添加硼酸钠，经优化：在pH=8，37℃，反应12h，底物浓度为400g/L，β-半乳糖苷酶加入量为12.5μL/g乳糖，硼酸钠浓度为0.05mol/L时，乳糖转化率为72.01%，GOS合成浓度为115.43g/L，GOS收率为28.86%，可见硼酸钠明显提高了GOS收率。 β-半乳糖苷酶CLEAs的制备及其性质研究：制备β-半乳糖苷酶CLEAs的最优条件为：原酶液稀释20倍，按体积比1:1加入异丙醇，4℃下沉淀30min，加入体积分数为0.125%交联剂戊二醛，4℃下交联30min，离心洗涤，酶活保留率可达45.77%，CLEAs的最适pH、最适温度范围拓宽、稳定性有所提高。 β-半乳糖苷酶磁性CLEAs的制备及其性质研究：为便于CLEAs的回收利用，制备过程中引入Fe3O4磁性纳米颗粒，优化制备条件：100μL0.042g/mL Fe3O4磁性纳米颗粒，加入2mL20mg/mL的BSA溶液中，磁力搅拌1.5h后洗涤，加入50μL β-半乳糖苷酶酶液，稀释至1mL，4℃下按体积比1:1加入异丙醇，沉淀60min，再加入体积分数0.125%的戊二醛，交联60min，得到酶活保留率为58.67%，且易于回收，重复利用性较好的β-半乳糖苷酶磁性CLEAs。