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β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖工艺开发及交联酶聚体的制备

邢肖肖  
【摘要】:本文以商业β-半乳糖苷酶为对象,研究了其工业应用制备低聚半乳糖(GOS)的工艺过程,以及β-半乳糖苷酶交联酶聚体(CLEAs)的制备方法。为了提高GOS的产率,开发了酶解过程中添加金属离子和硼酸钠的新工艺;为解决β-半乳糖苷酶的回收再利用问题,开发了CLEAs的制备工艺,并针对传统CLEAs回用时高速离心导致部分酶失活且能耗高的缺陷,优化获得了β-半乳糖苷酶磁性CLEAs的制备新工艺。本文主要研究结论如下: β-半乳糖苷酶制备GOS工艺条件: pH=8,37℃,400g/L乳糖浓度,酶加入量25μL/g(酶/乳糖),反应2h,乳糖转化率为60.28%,GOS生成浓度为58.22g/L,GOS产率为14.56%。 离子对β-半乳糖苷酶酶活的影响及应用:浓度低于1mol/L的一价离子(K+、NH4+、Na+)中除Na+对水解活性无影响外,其余离子对β-半乳糖苷酶转糖苷活性和水解活性均具有激活作用;浓度高于1mol/L的一价离子抑制β-半乳糖苷酶酶活,且为可逆失活。在离子存在时,制备GOS的理想工艺条件为:37℃、pH=8的Tris-HCl缓冲液、0.08mol/L KCl,初始乳糖浓度500g/L,加酶量10μL/g乳糖,反应5h,乳糖转化率为65.14%,GOS浓度达到94.74g/L,GOS收率为23.69%,与未加金属离子的体系对比,乳糖转化率提高8.06%,GOS收率提高62.71%。 硼酸钠对制备GOS的影响:利用硼酸钠中Na+能够提高β-半乳糖苷酶的转糖苷活性,硼酸可以络合葡萄糖和半乳糖提高乳糖酶解率的特性,在制备GOS过程中添加硼酸钠,经优化:在pH=8,37℃,反应12h,底物浓度为400g/L,β-半乳糖苷酶加入量为12.5μL/g乳糖,硼酸钠浓度为0.05mol/L时,乳糖转化率为72.01%,GOS合成浓度为115.43g/L,GOS收率为28.86%,可见硼酸钠明显提高了GOS收率。 β-半乳糖苷酶CLEAs的制备及其性质研究:制备β-半乳糖苷酶CLEAs的最优条件为:原酶液稀释20倍,按体积比1:1加入异丙醇,4℃下沉淀30min,加入体积分数为0.125%交联剂戊二醛,4℃下交联30min,离心洗涤,酶活保留率可达45.77%,CLEAs的最适pH、最适温度范围拓宽、稳定性有所提高。 β-半乳糖苷酶磁性CLEAs的制备及其性质研究:为便于CLEAs的回收利用,制备过程中引入Fe3O4磁性纳米颗粒,优化制备条件:100μL0.042g/mL Fe3O4磁性纳米颗粒,加入2mL20mg/mL的BSA溶液中,磁力搅拌1.5h后洗涤,加入50μL β-半乳糖苷酶酶液,稀释至1mL,4℃下按体积比1:1加入异丙醇,沉淀60min,再加入体积分数0.125%的戊二醛,交联60min,得到酶活保留率为58.67%,且易于回收,重复利用性较好的β-半乳糖苷酶磁性CLEAs。


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