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β-半乳糖苷酶发酵制备工艺研究与酶制剂剂型开发

尤生萍  
【摘要】:β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)属于水解酶,能特异性水解β-D-半乳糖苷类化合物的β-D-半乳糖苷键,同时具有转糖苷活力,可以用来催化生成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶广泛应用于食品工业、医学和生化分析等领域。本文以乳酸克鲁维酵母发酵产β-半乳糖苷酶为研究核心,首先从上游发酵制备入手,采用响应面分析法优化培养基组成和培养条件,在小试阶段(7L发酵罐)进行发酵过程优化和新型流加培养技术的开发,并开展了以乳清粉为碳源和主要能量来源的工业培养基开发,最后进行下游β-半乳糖苷酶酶制剂的制备研究。主要研究内容与结果如下: 通过响应面分析法得到最优培养基配方与摇瓶培养条件:乳糖20g/L,蛋白胨5g/L,酵母膏12g/L,麦芽浸膏5g/L,Na2HPO412H2O0.01mol/L,MgSO40.6g/L,FeSO40.06g/L,pH8.48,温度27.6oC,接种量5%(v/v)。在此条件下,β-半乳糖苷酶的发酵酶活达到20.60U/mL,比原始培养条件中酶活(6.85U/mL)提高了约两倍。 以上述优化实验条件为基础进行小试阶段(7L发酵罐)的发酵过程优化,其结果为:当搅拌转速为200rpm,通气量为5L/min时。在该条件下,β-半乳糖苷酶酶活可达48.41U/mL,生物量达到7.21g/L。为了进一步提高β-半乳糖苷酶产量,研究开发了一套pH值反馈调控的新型流加培养技术,培养21h后,β-半乳糖苷酶酶活、生产效率及生物量分别高达111.61U/mL、5.31U/(mL h)和10.73mg干细胞/mL,与间歇培养相比,分别提高了1.31倍,3.18倍和0.49倍。 以乳清粉为主要原料开发了一套理想的工业培养基配方:乳清粉60g/L,酵母膏9g/L,蛋白胨3g/L,MnCl20.03g/L,ZnCl20.058g/L,pH8.0。从摇瓶阶段和小试阶段的综合分析,该工业配方产酶效率与已优化的传统配方大体一致,但是,前者获得的特殊酶活远高于后者,所以,前者更适合后续的β-半乳糖苷酶酶制剂制备。 以上述小试阶段发酵制备所得β-半乳糖苷酶细胞液为原料,经优化获得了透性细胞处理方法。采用自然干燥、冷冻干燥和喷雾干燥三种干燥方法处理透性细胞悬浮液制备β-半乳糖苷酶酶制剂,综合分析可知,自然干燥法获得的酶制剂酶活保留率高,特殊酶活高,产品质量良好,具有进一步研究的意义。


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