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《天津大学》 2018年
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DNA催化剂的仿生构建及其在可视化检测中的应用

何钏  
【摘要】:天然酶是调节生物体内生物过程的催化剂,它具有催化效率高,底物专一性强和反应条件温和等特点,但在实际应用中经常会受到稳定性低、价格高昂、不能够长期储存等缺点的限制,因此,人工合成的用来模拟天然酶的结构和功能的仿生催化剂应运而生,且被人们广泛应用于化工、医学、食品、农业和环境等领域。本文通过调节DNA的序列组成与二级结构,构建了DNA仿生催化剂,并成功应用于血液中核酸外切酶、碱性磷酸酶的高灵敏可视化检测。首先,研究设计了一系列含有不同个数鸟嘌呤的寡核苷酸短序列(T_xG_y,x+y=5,y=0~3),以及含有不同重复单元数的寡核苷酸链(T_3G_2)_n和(T_2G_3)_n(n=1~10),通过Cu~(2+)和DNA碱基间的配位作用构建了具有类过氧化物酶活性的DNA-Cu(Ⅱ)复合物。研究表明,连续的鸟嘌呤对其催化活性至关重要,T_2G_3-Cu(Ⅱ)的活性是单独Cu~(2+)的36倍。随着重复单元的增加,(T_3G_2)_n-Cu(Ⅱ)与(T_2G_3)_n-Cu(Ⅱ)(n=1~10)的催化活性经历了三个变化阶段,分别为快速增加、缓慢增加和轻微下降,两组序列的最优重复单元个数为8和6。在过氧化氢(H_2O_2)存在的条件下,DNA-Cu(Ⅱ)复合物可在酸性pH下催化四甲基联苯胺(TMB)氧化、中性条件下催化多巴胺(DA)氧化以及碱性pH下催化亚甲基蓝(MB)氧化。重要的是,S1核酸酶通过切割DNA使DNA-Cu(Ⅱ)的类酶活降低,研究依此建立了一种S1核酸酶的比色检测法,检测限为0.017 U/mL、线性范围为0.001~0.1 U/mL,对S1核酸酶具有高选择性。其次,研究设计了不同序列组成(A、T、G、C)与长度的单链寡核苷酸,发现了富含鸟嘌呤(G)的DNA序列能够催化乙酸与H_2O_2反应生成过氧乙酸(PAA);同时,有机底物TMB能够与DNA分子结合,并与原位生成的PAA发生氧化反应。寡核苷酸链的长度显著影响了PAA的生成,并且DNA二级结构的形成在一定程度上抑制了其催化氧化活性。在25 ~oC时,实验分别在10 mM、30 mM的乙酸钠(NaAc)体系中测得了TG_3T和(TG_3T)_2序列的酶动力学参数,TG_3T和(TG_3T)_2在30 mM NaAc中对H_2O_2的亲和力是10 mM NaAc体系的3.3倍;而(TG_3T)_2对TMB的亲和力是TG_3T的2倍。此外,研究还发现了磷酸根能够有效抑制寡核苷酸的催化氧化活性,因此,利用3’和5’端磷酸化的(TG_3T)_2建立了一种具有高灵敏度和选择性的碱性磷酸酶(ALP)的比色检测方法,检测限为0.057 mU/mL、检测范围为1~40 mU/mL,对血液中其他蛋白质具有较强的抗干扰能力。
【学位授予单位】:天津大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q811

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