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《天津大学》 2018年
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转录因子CodY与DNA结合的功能域及关键氨基酸解析

赵悦  
【摘要】:乳酸乳球菌F44中全局性的转录调控因子CodY能够调控碳代谢、氮代谢、寡肽转运、氨基酸降解、毒力、环境适应以及遗传转化等过程。发酵过程中随着乳酸的不断积累,发酵液中的pH不断下降会阻碍菌体的生长,甚至导致细菌死亡。细胞壁作为菌体对抗外界环境的第一道屏障在保护细菌方面发挥至关重要的作用。本实验室前期利用DNA pull-down和凝胶阻滞实验(EMSA)找到能够调控编码D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶ddl基因转录的全局转录因子CodY。在此基础上,结合文献和生物信息学分析发现其他细胞壁肽聚糖合成相关基因也存在相似DNA结构域。为了进一步研究CodY调控因子对乳酸乳球菌细胞壁合成的调控机制,本文通过表达、纯化CodY蛋白和体外EMSA实验,验证了CodY蛋白能够与细胞壁肽聚糖合成基因murC、murD和murG的启动子区序列结合。另外,支链氨基酸(BCAAs)是乳酸乳球菌CodY转录调控因子的唯一效应因子,本文通过外加BCAAs,确定其能够加强CodY蛋白和DNA结合的稳定性,促进二者的结合,其中对murC和murD的促进较显著。进一步通过MEME分析预测得到转录调控因子CodY与DNA结合的一个保守DNA结合域(Motif),并结合突变保守域和EMSA验证证实CodY蛋白通过与多个Motif 5’-CTGWCAG-3’结合,调控肽聚糖合成基因ddl的转录。另外,通过分子模拟实验预测到在与DNA结合结构域(wHTH)中与DNA序列结合的关键氨基酸,PCR定点突变实验将重要氨基酸突变为非极性丙氨酸,并且体外EMSA实验证明第218位精氨酸,第227位赖氨酸以及第237位精氨酸在CodY与ddl启动子结合时发挥重要作用。综上所述,本研究对乳酸乳球菌F44中转录调控因子CodY与DNA结合的功能域及关键氨基酸进行了初步的解析,验证了CodY蛋白能够结合在细胞壁肽聚糖合成基因murC、murD和murG的转录起始区域,并证实了与DNA结合的关键Motif和氨基酸,为乳酸乳球菌细胞壁调控机制及转录因子CodY调控机制的全面解析提供提供了新的视角。
【学位授予单位】:天津大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q75

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