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《天津大学》 2003年
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米曲霉氨基酰化酶的固定化及其拆分N-乙酰-DL-苯甘氨酸的研究

王燕  
【摘要】: 本文首次以氨基酰化酶为酶源拆分非天然氨基酸—N-乙酰-DL-苯甘氨酸。实验首先以固定化米曲霉菌体为酶源在间歇反应器中进行初步拆分,进而利用拆分效率相对较高的固定化酶在连续床中进行最后拆分。本文采用理论分析与实验研究相结合的方法,综合运用数学建模、过程模拟等多种手段,对氨基酰化酶拆分N-乙酰-DL-苯甘氨酸的酶解体系进行了较全面系统的研究,内容涉及菌体的培养、菌体和酶的固定化及其性质表征、酶分子的作用机理及酶促反应动力学、反应器的模型计算等方面,主要包括 1通过对各种不同类型培养基的比较,筛选出了适宜的液体培养基—豆汁培养基,得到了菌体培养的适宜条件:30℃,pH值自然,转速130rpm,接种量4%,培养40h。该菌体用于拆分N-乙酰-DL-苯甘氨酸时菌体的比酶活可达1600-1800U·g-1。以甲醛为交联剂,惰性蛋白明胶为包埋剂和活性保护剂,对米曲霉菌体进行固定化。在正交实验的基础上利用人工神经网络得到了较优的固定化条件:菌体与固定液的用量比(固液比)为1:8,其中固定液中明胶浓度为0.5%,甲醛浓度为0.5%,固定化时间为1.5h。在此条件下制得的固定化菌体比酶活达到1500U·g-1,酶活保留率超过80%。固定化后米曲霉菌体热稳定性明显增强,在连续反应器中的操作半衰期可达77d。最佳反应条件pH值从7.0变为8.0、温度由52℃变为63℃,最适反应条件明显变宽。Co2+浓度为1×10-3mol·L-1时对固定化菌体的激活作用达到最强。 2研究了固定化米曲霉菌体拆分N-乙酰-DL-苯甘氨酸的的催化特性。当底物浓度大于200mmol·L-1时,产生底物抑制。产物乙酸和L-苯甘氨酸(L-PG)分别产生非竞争性抑制和竞争性抑制。在37℃条件下,固定化菌体的米氏常数、底物抑制常数、产物乙酸的抑制常数和L-苯甘氨酸的抑制常数分别为19.8mmol·L-1、225.5mmol·L-1、38.7mmol·L-1和20.23mmol·L-1。 3从酶反应动力学基本方程出发,考虑各种抑制物的作用特点,提出了新的分子作用机理,建立了新的动力学方程。固定化菌体在间歇反应器中的实验数据表明,当底物浓度较低时,该方程与Warburton方程和Cleland方程均能很好地与实验结果相吻合;随着底物浓度的增大和反应的进行,除新的动力学方程仍能很好地与实验结果吻合外,其它两个方程与实验结果的偏差越来越大,表明本文提出的分子作用机理更为合理。 4采用结构与DEAE-Sephadex极其相似的大孔弱碱性树脂DEAE-E/H作为氨基酰化酶的固定化载体。考察了影响固定化结果的因素,确定了适宜的固定化条 WP=4 件:自由酶液浓度为120U·ml-1,pH值6.5左右,温度为室温。在此条件下制得的固定化氨基酰化酶比酶活可达1200-1500U·g-1,酶活保留率超过60%,与文献报道的DEAE-Sephadex固定化效果相当,固定化后酶的稳定性大大提高。固定化酶的米氏常数、底物抑制常数、产物乙酸和苯甘氨酸的抑制常数和分别为5.668mmol·L-1、763mmol·L-1、400mmol·L-1和10.0mmol·L-1。 5 对固定床反应器中固定化氨基酰化酶连续拆分N-乙酰-DL-苯甘氨酸的反应进行模拟,用推广的割线法求解模型,模型的计算值与实验结果吻合较好。最后所得产品D-苯甘氨酸的旋光度为= -157o (C=1,1mol·L-1 HCl),产品的光学纯度为99.4%。理论收率达到65.1%。
【学位授予单位】:天津大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:O629.8

【引证文献】
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【参考文献】
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10 吕维莉,魏源文,邓智年;植物修复技术研究进展[J];广西农业科学;2004年02期
【二级引证文献】
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【二级参考文献】
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