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《天津大学》 2005年
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运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建及大肠杆菌K-12 talB基因的表达

葛建平  
【摘要】:运动发酵单胞菌属于革兰氏阴性菌,微好氧生长。Z.mobilis是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种。Z.mobilis可利用的碳源仅为葡萄糖、果糖和蔗糖,利用基因工程手段改造Z.mobilis,拓宽其可利用碳源的范围,是当前Z.mobilis基因工程改造工作的首要任务之一。 基因工程改造首先需要有好的载体系统。本研究以Z.mobilis ATCC10988中内源质粒pZM2(2749bp)和E.coli中的质粒pBR328(4907bp)、pACYC184(4245bp)为出发质粒,构建Z.mobilis-E.coli之间的克隆型穿梭质粒。首先分别制备含pZM2的复制区和分配区的DNA片段,插入到pBR328的四环素抗性基因中,构建出pZB2(Ap~r、Cm~r,pZM2复制区)和pZB3(Ap~r、Cm~r,pZM2复制区和分配区);进一步分离pACYC184中的四环素抗性基因DNA片段,分别连接到pZB2和pZB3中,得到pZB21(Ap~r、Cm~r、Tc~r,pZM2复制区)和pZB31(Ap~r、Cm~r、Tc~r,pZM2复制区和分配区);然后分别对pZB21、pZB31在E.coli DH5a和Z.mobilis CP4中的稳定性、拷贝数进行了比较分析,结果是:pZB21、pZB31都优于实验室先前构建的pZB1,而pZB31又优于pZB21,故选定pZB31作为穿梭载体。最后,以pZB31为载体,在Z.mobilis CP4中表达E.coli K-12的talB基因,酶活水平达0.051 U/mg蛋白,高于以pZB1为载体的相同基因的表达水平(为0.035 U/mg蛋白)。 通过以上工作,构建得到了一个能满足使用要求的、较为理想的Z.mobilis-E.coli之间的穿梭载体即pZB31,其具有与pBR328完全相同的抗性标记。
【学位授予单位】:天津大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:TQ920.1

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