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《天津大学》 2006年
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苹果酸脱氢酶包涵体的表达及复性研究

付敏玲  
【摘要】: 苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase,EC 1.1.1.37,MDH)是一种重要的糖代谢酶,在生物体内特异性催化L-苹果酸成为草酰乙酸从而完成三羧酸循环。可利用MDH底物专一性特征,将其用于拆分DL-苹果酸以得到重要的手性碳源D-苹果酸。此外,MDH具有同源二聚体分子结构,这一结构的特殊性决定了MDH常被用作于寡聚蛋白分子的结构及功能研究的模型分子。鉴于MDH重要的经济及科研价值,本文以大肠杆菌苹果酸脱氢酶(E.coli MDH,eMDH)为研究对象,进行了eMDH的克隆、表达及复性研究。 首先运用PCR方法从大肠杆菌基因组DNA中扩增出编码eMDH的cDNA,将其与温控质粒载体pBV220连接构建重组质粒;经限制性内切酶酶切分析及全序列分析得到阳性重组子。继而进行基因工程菌培养,42℃诱导外源蛋白eMDH的表达。SDS-PAGE分析发现外源蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在于破菌沉淀中;经电泳凝胶光密度扫描分析得目标蛋白表达量占全菌蛋白的42%;包涵体蛋白的产量为87.3mg?(L培养液)-1。对包涵体蛋白进行脲及Triton洗涤纯化后,蛋白纯度由表达后的42%增加到72%。 在包涵体复性得研究中,重点考察了人工伴侣体系对eMDH包涵体的促进复性作用。结果显示,当酶浓度为0.1mg?mL-1,CTAB与β-环糊精的浓度比为0.6mmol?L-1:4.8 mmol?L-1 (1:8),pH值为7.6,变性剂脲终浓度为0.32 mol?L-1及5mmol?L-1 DTT存在时,人工伴侣可有效辅助eMDH复性,复性后的比活可达160U/mg。 利用荧光光谱法、圆二色光谱法分析表明,复性后的eMDH具有正确的分子结构。体积排阻色谱分析证明,其比自发复性的eMDH含有更多的二聚体分子。另外,温度动力学结果显示,低温有利于降低eMDH分子的折叠反应速率,提高eMDH的复性比活;与自发复性相比,人工伴侣辅助复性体系,可以降低eMDH的折叠速率,有效协助eMDH折叠为正确的结构。
【学位授予单位】:天津大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:TQ920.1

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