~（13）C标记技术测定zwf敲除E.coli厌氧中心代谢通量的初步研究

【摘要】： 本文拟采用核磁共振(NMR)的定量分析手段,通过对13C标记的中间代谢产物标记状态的定量分析,对大肠杆菌zwf基因敲除菌株的中心代谢网络通量进行确定。为今后分析确定大肠杆菌生产琥珀酸新的基因改造靶点提供指导依据。由于时间、设备和药品的限制,本文仅初步通过实验确定zwf基因敲除大肠杆菌厌氧发酵条件下NMR实验前期的恒化操作条件参数和步骤。并从理论上对实验前期的标记策略和最小测定代谢物组、实验后期的NMR谱图解析和数据处理等问题建立起一整套分析方法。 由于核磁共振底物定量选取策略的复杂性,本文主要采用定性的方法对底物标记方法进行确定,以实验得的NMR谱图的分辨率和信号强度的相对最优化为选取策略目标;最小测定代谢物组的选取采用了定量的分析方法,以测量中间代谢物数量和计算通量数据可靠性的相对最优化为选取标准。分别从各个代谢物基本解NMR谱分辨率、各个代谢物组合通量解析能力以及经济因素三个方面来考虑,作出了定量分析。 在NMR谱图数据分析方面,选取采用NUTs核磁定量分析软件,阐明了如何根据NMR谱图分析计算得到最小测定代谢物组中各个同位素异构体的所占的摩尔百分含量,即最小测定代谢物组的IDV,后面的中心代谢网络通量的计算提供可靠的实验数据基础。 本文中心代谢网络通量的计算可分为三个步骤,首先是分析计算出所选中心代谢网络各个反应的同位素作图矩阵(IMM),再由网络的反应计量约束用混合整数线性规划(MILP)的方法得到通量解空间的所有基本解,最后以模拟NMR数据和实验得到的最小代谢物组数据之差最小为优化目标,用空间分支分割非线性优化的方法计算的得到大肠杆菌中心代谢网络的通量值。