CTB-LK在毕赤酵母和向日葵中的表达、检测及其活性分析

【摘要】： 血栓性疾病,尤其是心、脑血管血栓性疾病,已成为我国死亡率最高的疾病之一,严重危害人类健康。蚓激酶(Lumbrokinase, LK)是从蚯蚓体内提取的一种具有纤溶活性的蛋白水解酶,在临床上对多种血栓疾病具有较好疗效。然而LK的口服吸收利用度不高以及在胃肠道内极易被降解,相对来说限制了其在临床上的应用。而霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit, CTB)是由霍乱弧菌产生的无毒的受体结合亚单位,具有结合真核细胞上的神经节苷脂受体的功能,目前大量研究集中在将其与目的抗原偶联或表达成融合蛋白后,使机体产生更强的抗特性抗原的黏膜和系统免疫应答。本文我们利用CTB的作用特点来探索其在非抗原抗体药物蛋白方面的是否具有较好的佐剂效果,以期利用CTB佐剂来提高LK的口服吸收利用率。 在研究中我们构建了LK表达载体pPIC9k-CTB-LK,并在CTB与LK之间引入了弗林蛋白酶水解位点,通过该位点的引入使CTB完成佐剂使命后被小肠上皮细胞中富含的弗林蛋白酶切掉,使得其与LK分开,同时在CTB下游添加(GGGGS)3 Linker序列,使得融合蛋白CTB-LK翻译表达后可以得到正确折叠。CTB-LK在毕赤酵母中得到高效表达,经过分离纯化后,通过纤维蛋白平板法实验和小鼠血栓模型的构建,说明LK蛋白提取物和CTB-LK蛋白提取物都具有LK纤维活性和抑制小鼠血栓形成的功效,而且CTB可以发挥其增强LK口服吸收利用的效果。此外,本实验中我们观察到毕赤酵母表达CTB-LK后可以催化前体硅酸钠形成二氧化硅复合物,进而对毕赤酵母进行包埋,这种包埋方法简单易行,且能体现出传统细胞包埋的特点。 最后,我们使用含Marker Free植物表达载体pX6-CTB-LK的农杆菌侵染向日葵子叶后得到转基因向日葵植株,以向日葵基因组DNA作为模板进行PCR检测,以及以向日葵基因组RNA作为模板进行RT-PCR检测,说明外源目的基因CTB-LK已经成功整合到向日葵基因组中,并实现转录,最终获得转基因种子两颗。 总之,本研究的结果揭示,重组CTB-LK融合蛋白为抗血栓蛋白类药物的研发奠定了良好的前期基础,也为利用CTB作为口服增强佐剂的口服药物蛋白的研发提供了良好的实验依据和理论依据。