西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析

【摘要】：本研究从106-107个分泌西维因抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,利用兼并引物分别扩增出抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,对其进行测序鉴定,确定其为小鼠抗体可变区片段,片段大小分别为324bp和360bp。根据基因序列重新设计特异性引物,重叠延伸PCR扩增出单链抗体(scFv)基因片段,经测序鉴定,片段连接正确,长度为729bp。将此scFv与表达载体pET30a连接,构建重组表达质粒scFv-pET30ao转化大肠杆菌BL21(DE3).利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明获得重组表达抗体,分子量大小约为33kDa,但是形成包涵体。采用透析法对包涵体进行复性,并对复性条件进行优化,结果显示最佳复性时间为48h,最佳起始蛋白浓度为200μg/mL,含有精氨酸的复性液效果最佳。利用亲和层析纯化scFv,并利用直接竞争ELISA检测其活性,结果显示该scFv对西维因具有良好的亲和性和特异性。 为了获得活性更好的基因工程抗体,本研究还在表达载体和信号肽方面探索,期望获得可溶性重组抗体。本研究重新设计引物,从构建成功的scFv-pET30a质粒中重新扩增了scFv,并将其与可溶性表达载体pET26b进行酶切连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),在20℃,不同IPTG浓度下,进行诱导表达12h, SDS-PAGE检测结果表明,0.05mmol/L IPTG浓度下有少量可溶性表达,分子量大小约为30kDa,在此条件下,大量制备可溶性抗体,用亲和层析柱纯化后,直接竞争ELISA检测发现这一抗体与复性抗体相比,在特异性和稳定性方面没有优势。 本研究还尝试了将有机磷农药降解酶(OPH)基因信号肽序列插入scFv-pET26b质粒,构建了OPH-scFv-pET26b重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),在20℃不同IPTG浓度下进行诱导表达12h, SDS-PAGE检测菌体破碎后的上清液中没有可溶性抗体的表达,重组蛋白形成了包涵体,分子量大小约为40kDa。