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《天津科技大学》 2010年
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牛肉风味强化肽在毕赤酵母中的组成型表达

孟琦  
【摘要】:牛肉风味强化肽(Beefy Meaty Peptide,BMP)最初是从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离得到的一种八肽,其一级结构为:Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-leu-Ala。BMP与食盐、味精有较好的协同呈味的作用,并且具有很好的热稳定性,适合于食品工业生产中的热处理要求。因此,BMP有望代替MSG成为新一代风味强化剂,具有广阔的市场前景。本课题主要研究采用基因工程方法在毕赤酵母(Pichia pastoris)中组成型表达BMP。 本课题在已构建出的带有BMP的高效表达载体pPIC9-16BMP (?)的基础上,为了降低毕赤酵母诱导表达体系中诱导物甲醇带来的危害和碳源转化问题,采用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOXI),实现在P.pastoris中组成型表达BMP的目的。 以p.pastoris GS115基因组DNA为模板PCR扩增PGAP,并将扩增的PGAP克隆于pPIC9-16BMP质粒,以取代PAOX1,构建成组成型表达载体pGAP9-16BMP.将线性化的pGAP9-16BMP r电转化P.pastoris GS115,由此构建成16BMP整合的毕赤酵母工程菌GS115(pGAP9-16BMP)。 优化工程菌GS115(pGAP9-16BMP)摇瓶发酵培养条件。SDS-PAGE结果显示,组成型转化子GS115(pGAP9-16BMP)于培养4d后BMP的表达已达高峰;YPD培养基中蛋白胨和酵母粉浓度提高一倍有利于BMP的表达;葡萄糖、甘油、山梨酸、油酸4种碳源浓度适当的加入均有利于BMP的表达,其中3%的甘油最好:挡板三角瓶装液量30%优于装液量20%、10%水平;菌体生长阶段控制在32℃利于BMP的表达;培养基的初始pH值为6时BMP产量较高。在5L发酵罐中以甘油为唯一碳源进行高密度发酵GS115(pGAP9-16BMP)工程菌组成型农达BMP,在发酵64h BMP表达已达高峰。 发酵液经过煮沸,离心取上清,先通过孔径60kDa的中空纤维进行初步纯化,经孔径为6000Da的中空纤维进行浓缩纯化,最后将2.8L发酵上清液浓缩为140mL。使用Invitrogen公司的His band resin,分离纯化得到16拷贝的BMP目的产物。并利用美拉德反应验证了BMP具有增香、提升肉质感的特性。
【关键词】:牛肉风味强化肽 GAP启动子 组成型表达 毕赤酵母
【学位授予单位】:天津科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TS251.1
【目录】:
  • 摘要4-5
  • ABSTRACT5-8
  • 1 前言8-29
  • 1.1 生物活性肽8-9
  • 1.1.1 生物活性肽的分类8
  • 1.1.2 生物活性肽吸收机制的六大特点8
  • 1.1.3 生物活性肽的特殊形式—呈味肽8-9
  • 1.2 肽的呈味作用9-10
  • 1.2.1 肽呈味作用的特点10
  • 1.3 牛肉风味强化肽10-11
  • 1.4 生物活性肽的生产方法11-13
  • 1.4.1 生物活性肽及风味肽的传统生产方法11-12
  • 1.4.2 生物技术生产生物活性肽的研究进展12-13
  • 1.4.3 生物技术生产牛肉风味强化肽的研究进展13
  • 1.5 巴斯德毕赤酵母表达系统13-22
  • 1.5.1 毕赤酵母表达系统的优点14-15
  • 1.5.2 毕赤酵母表达系统的构成15-19
  • 1.5.3 巴斯德毕赤酵母的转化19-21
  • 1.5.4 影响毕赤哮母外源蛋白表达的因素21-22
  • 1.6 重组酵母菌的组成型表达22-24
  • 1.6.1 优化重组酵母菌摇瓶发酵条件22-23
  • 1.6.2 重组酵母菌的高密度发酵表达23-24
  • 1.7 中空纤维与His Bind Resin纯化柱24-26
  • 1.7.1 中空纤维超滤24-25
  • 1.7.2 His Bind Resin纯化柱25-26
  • 1.8 美拉德呈味反应26-27
  • 1.9 本课题研究的意义与研究内容27-29
  • 1.9.1 研究的目的和意义27-28
  • 1.9.2 研究的主要内容28-29
  • 2 材料与方法29-46
  • 2.1 实验材料29-34
  • 2.1.1 菌种及质粒29
  • 2.1.2 试剂29-30
  • 2.1.3 工具酶及DNA、蛋白质Marker、引物30-31
  • 2.1.4 抗生素31
  • 2.1.5 His Bind Purification Kit (Novagen)31
  • 2.1.6 实验仪器31-32
  • 2.1.7 培养基32-34
  • 2.2 实验方法34-46
  • 2.2.1 标准溶液的配制34-35
  • 2.2.2 组成型表达载体pGAP9-16BMP的构建35-40
  • 2.2.3 毕赤酵母工程菌GS115(pGAP9-16BMP)的构建及验证40-41
  • 2.2.4 GS115(pGAP9-16BMP)发酵表达BMP41-44
  • 2.2.5 美拉德反应及呈味实验44-46
  • 3 结果与讨论46-62
  • 3.1 pGAP9-16BMP载体的构建46-48
  • 3.1.1 PCR扩增酵母菌GS115的GAP启动子46
  • 3.1.2 pGAP9-16BMP载体的构建46-48
  • 3.2 毕赤酵母工程菌GS115(pGAP9-16BMP)构建结果分析48-50
  • 3.3 毕赤酵母工程菌GS115(pGAP9-16BMP)摇瓶发酵条件的研究50-58
  • 3.3.1 种子质量的研究50-51
  • 3.3.2 毕赤酵母工程菌GS115(pGAP9-16BMP)摇瓶发酵培养基的优化51-54
  • 3.3.3 对GS115(pGAP9-16BMP)发酵条件的研究54-58
  • 3.4 发酵罐高密度发酵产BMP58
  • 3.5 中空纤维超滤浓缩发酵液中的BMP58-60
  • 3.6 His bind resin纯化目的蛋白60-61
  • 3.7 美拉德呈味反应61-62
  • 4 结论62-64
  • 5 展望64-65
  • 6 参考文献65-72
  • 7 攻读硕士学位期间发表论文情况72-73
  • 8 致谢73

【参考文献】
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