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《天津科技大学》 2015年
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新型吲哚类白三烯A_4水解酶抑制剂的活性研究

杨尧  
【摘要】:白三烯A4水解酶(LTA4H)是花生四烯酸代谢途径中水解白三烯A4(LTA4)产生白三烯B4(LTB4)的关键酶,LTA4H的水解产物LTB4是许多急性和慢性炎症的重要化学介质。近期的研究表明,LTA4H除了在炎症发生发展过程中扮演重要角色,还与多种恶性肿瘤的发生息息相关。因此,开发新型白三烯A4水解酶抑制剂具有十分重要的意义。吲哚是一种广泛存在于动物体内的天然产物,具有良好的抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗病毒等生物活性。本课题组前期根据LTA4H的结构设计合成了一系列吲哚类衍生物,本论文以这些吲哚类衍生物为研究对象,讨论了候选化合物对LTA4H的水解酶活性和氨肽酶活性的影响,并进一步研究了这些化合物抑制人结直肠癌HT-29细胞和宫颈癌HeLa细胞增殖的构效关系。首先,本论文建立了 LTA4H的原核表达质粒并初步纯化得到了 LTA4H蛋白,为候选化合物的活性筛选构建了测试平台。然后,分别测定了 10个吲哚类衍生物对LTA4H蛋白水解酶活性及氨肽酶活性的影响,实验结果表明:HKL 143-1,HKL 135-1及HKL 160三种化合物较其他化合物对水解酶抑制活性好,分别为6.15 μM、4.97[iM和3.83μM;HKL-A058-23,HKL135-1,HKL160及HKL162四种化合物较其他化合物对氨肽酶抑制活性好,分别为7.08 μM、16.48 μM、11.4 μM及20.45 μM。最后分别选取内源LTA4H表达量高的结直肠癌细胞株HT-29及表达量低的宫颈癌细胞株Hela进行抗肿瘤活性测试,结果表明化合物HKL 5-61、HKL 139-1、HKL 2-3-15、HKL135-1、HKL-A058-23及HKL160选择性的对HT-29细胞表现出了良好的抗肿瘤活性,分别为 0.06 μM、1.41 μM、0.08 μM、0.14 μM、3.97 μM 及 3.19 μM,但对 Hela细胞并没有表现出良好的抗肿瘤活性,其中HKL 5-61、HKL-A058-23对Hela细胞的抑制作用与HT-29相比分别相差390倍和147倍,而选择性最好的化合物HKL 160对Hela细胞完全没有表现出抑制作用。以上实验结果表明:我们筛选得到了吲哚类衍生物HKL 160不仅具有良好的LTA4H抑制活性,而且对内源高表达LTA4H的HT-29细胞有良好的抑制活性,因此我们推测:化合物HKL 160通过调节LTA4H的活性实现来对肿瘤细胞增殖的抑制作用。本结果为后续该化合物的作用机制研究及开发吲哚类LTA4H抑制剂的研究奠定了基础。
【关键词】:白三烯A_4水解酶 白三烯A_4水解酶抑制剂 抗肿瘤
【学位授予单位】:天津科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R96
【目录】:
  • 摘要4-5
  • ABSTRACT5-8
  • 1 前言8-22
  • 1.1 花生四烯酸8-10
  • 1.1.1 花生四烯酸的生理作用8-9
  • 1.1.2 花生四烯酸的代谢9-10
  • 1.2 白三烯(LTs)10-13
  • 1.2.1 白三烯概述10
  • 1.2.2 白三烯的生物合成10-11
  • 1.2.3 白三烯的生物活性11-13
  • 1.3 白三烯A_4水解酶13-14
  • 1.3.1 白三烯A_4水解酶的结构13
  • 1.3.2 白三烯A_4水解酶的作用机制13-14
  • 1.4 白三烯A_4水解酶抑制剂的研究进展14-15
  • 1.4.1 白三烯A_4水解酶抑制剂靶点14
  • 1.4.2 底物类似物14-15
  • 1.4.3 锌离子螯合剂15
  • 1.4.4 非螯合型抑制剂15
  • 1.4.5 其他类型LTA_4H抑制剂15
  • 1.5 吲哚类化合物15-17
  • 1.5.1 吲哚类化合物16
  • 1.5.2 吲哚类衍生物的药理作用16-17
  • 1.6 立题依据和研究内容17-22
  • 1.6.1 立题依据17-21
  • 1.6.2 研究内容21-22
  • 2 材料与方法22-37
  • 2.1 实验材料22-25
  • 2.1.1 菌株、质粒和细胞22
  • 2.1.2 药品与相关试剂22-24
  • 2.1.3 主要设备仪器24
  • 2.1.4 相关溶液配制24-25
  • 2.2 实验方法25-32
  • 2.2.1 LTA_4H重组表达质粒的构建25-30
  • 2.2.2 LTA_4H蛋白表达30
  • 2.2.3 LTA_4H蛋白纯化30-31
  • 2.2.4 LTA_4H蛋白纯化条件的优化31-32
  • 2.3 吲哚类衍生物对LTA_4H活性的影响32-35
  • 2.3.1 吲哚类衍生物对LTA_4H的水解酶活性影响32-34
  • 2.3.2 吲哚类衍生物对LTA_4H的氨肽酶活性影响34-35
  • 2.4 吲哚类衍生物对HT-29细胞及HeLa细胞增殖的影响35-37
  • 3 结果与讨论37-63
  • 3.1 LTA_4H重组表达质粒的验证及其蛋白诱导表达与纯化37-40
  • 3.1.1 LTA_4H重组表达质粒的构建37-38
  • 3.1.2 LTA_4H蛋白表达与纯化38-39
  • 3.1.3 LTA_4H蛋白纯化条件的优化39-40
  • 3.1.4 小结40
  • 3.2 吲哚类衍生物对LTA_4H活性的影响40-60
  • 3.2.1 吲哚类衍生物对LTA_4H的水解酶活性影响40-50
  • 3.2.2 吲哚类衍生物对LTA_4H水解酶抑制活性的小结50
  • 3.2.3 吲哚类衍生物对LTA_4H的氨肽酶活性影响50-60
  • 3.2.4 吲哚类衍生物对LTA_4H氨肽酶抑制活性的小结60
  • 3.3 吲哚类衍生物对HT-29细胞和HeLa增殖的影响60-63
  • 4 结论63-64
  • 5 展望64-65
  • 6 参考文献65-72
  • 7 攻读硕士学位期间发表论文情况72-73
  • 8 致谢73

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