米曲霉β-半乳糖苷酶的基因克隆与酶学特征分析

【摘要】：β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23)是普遍存在的酶,能够水解二糖、复合糖及多糖的末端β-D-半乳糖基部分。β-半乳糖苷酶属于水解酶,并且在明确的反应条件下可以催化转糖基反应合成低聚半乳糖(GOS)。β-半乳糖苷酶可将牛乳和乳制品中的主要糖成分乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,用于治疗人体内缺乏乳糖酶而引起的乳糖不耐受症。β-半乳糖苷酶的应用范围从分析研究到糖重构学,并广泛应用于生物、医药等领域。2015年米曲霉RIB40基因组的公布,使得研究全基因组下β-半乳糖苷酶系成为可能。通过分析米曲霉基因组序列信息,发现其基因组中至少有4个编码β-半乳糖苷酶的基因序列,但它们之间的生化活力与功能差异性等方面未知。为此,本研究通过分子克隆技术将米曲霉β-半乳糖苷酶系进行克隆表达,并就其生化特征与黑曲霉来源的β-半乳糖苷酶系进行比较分析,以期较为系统的比较其异同属性,为开发新一代β-半乳糖苷酶产品,并实现其大规模工业化生产与应用奠定基础。主要结果如下:通过PCR技术扩增米曲霉F1005F3个β-半乳糖苷酶的基因O158、AO及076,在构建重组表达质粒pPIC-O158、pPIC-AO及pPIC-O76的基础上,构建并通过His+筛选及G418抗性筛选,获得了分泌表达β-半乳糖苷酶的重组巴斯德毕赤氏酵母 GS115(pPIC-O158)、GS115(pPIC-AO)、GS115(pPIC-O76)。对重组酵母进行摇瓶发酵,在0.5%(v/v)甲醇诱导条件下发酵120 h,能够分泌表达β-半乳糖苷酶。本研究进一步对三个重组酶的酶学性质进行了分析,重组β-半乳糖苷酶O158、AO及O76的最适作用pH分别为4.0、5.5、7.0;最适作用温度均为50℃;在pH4.5-7.5之间和低于40℃均具有良好稳定性;Mn2+对重组β-半乳糖苷酶O158、AO和O76有明显的激活作用,Fe2+及Cu2+有明显的抑制作用;以乳糖为底物采用双倒数作图法测得O158、AO和O76的Km分别是5.48 mmol/L、5.27 mmol/L和6.21mmol/L;通过研究底物特异性,发现O158、AO及O76对乳糖均具有专一性。本研究明确了 β-半乳糖苷酶O158、AO和O76的酶学性质并作出了比较,系统地研究了来源于米曲霉的三个β-半乳糖苷酶的异同属性,为今后的表达和开发利用奠定了基础。