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《天津科技大学》 2018年
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谷氨酸棒状杆菌半胱氨酸转运蛋白的鉴定与特性研究以及半胱氨酸单细胞生物传感器的构建与应用

刘川  
【摘要】:半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,在食品、药品以及化妆品行业中都有着广泛的应用。在发酵生产中,增强细胞对半胱氨酸的外排可以提高其产量;高通量筛选技术的应用也有助于半胱氨酸高产菌株的分离。然而谷氨酸棒状杆菌中还没有半胱氨酸转运蛋白的相关报道;另一方面,还没有可以与高通量筛选技术相结合的半胱氨酸检测方法,本课题即围绕以上两点问题展开研究。通过对大肠杆菌、菠萝泛菌中已知的半胱氨酸转运蛋白进行生物信息学比对,在谷氨酸棒状杆菌中发现了 5个同源蛋白序列:Cg1298-1299,Cg1281,Cg3038,Cg1100-1101和Cg2277-2279。在大肠杆菌半胱氨酸敏感菌株中表达Cg1298-1299,Cg3038,Cg1100-1101,Cg2277-2279恢复了菌株在半胱氨酸中的生长能力。在谷氨酸棒状杆菌13032中敲除Cg1298-1299削弱了菌株在半胱氨酸中的生长能力,在该缺失突变体中表达Cg1298-1299后恢复了菌株的半胱氨酸耐受性。通过实时定量PCR证明cg1298-1299的转录水平受到半胱氨酸的诱导而上调,而另外4个转运蛋白基因的转录水平则由于半胱氨酸的诱导有不同程度的下调。利用绿色荧光蛋白与Cg1298-1299构建了融合蛋白,确定了 Cg1298-1299定位在细胞外周部位。在半胱氨酸高产谷棒菌中过表达Cg1298-1299,菌株的半胱氨酸产量相比野生型提高了14%。另外,一种半胱氨酸的单细胞生物传感器被构建出来,用于筛选半胱氨酸高产菌株。它基于转录调控因子CcdR,并将半胱氨浓度与荧光强度信号相偶联。该传感器具有很高的专一性,并且在0mmol/L至32mmol/L浓度的半胱氨酸下,半胱氨酸浓度与荧光/酶活信号之间具有良好的线性关系。最后,该生物传感器被与高通量筛选系统相结合以筛选半胱氨酸高产菌株,经过对5万个菌株进行筛选,获得了 11个荧光提高的突变体。在发酵实验中四株突变体菌株的半胱氨酸产量相比于野生型有所提高,其产量分别为野生型的110%,120%,210%,320%。这些实验结果说明,该半胱氨酸单细胞传感器可以应用在半胱氨酸生产菌株的改良中。
【学位授予单位】:天津科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q936;TP212

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