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《天津科技大学》 2004年
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根霉纤溶酶发酵、纯化和酶学性质研究

刘晓兰  
【摘要】:血栓栓塞性疾病严重威胁人类生命和健康,溶栓治疗是血栓性疾病安全有效的手段。目前临床使用的溶栓药物疗效肯定,但还存在许多缺陷,而且价格昂贵。因此研制高效、快速、副作用小,价廉的新型溶栓药物的需求迫切。微生物是获得溶栓剂的重要来源。 本论文对产纤溶酶的菌株根霉12#(Rhizuopus chinensis)进行了诱变育种,优化了根霉12#产纤溶酶的固态发酵和液态发酵条件,建立了根霉纤溶酶制备分离纯化的方法并进行了优化,研究了根霉纤溶酶的性质。 以分离自中国南方小酒药的产纤溶酶的一株中国根霉12#为出发菌株,对其进行紫外线—氯化锂复合诱变处理,筛选到74株制霉素抗性突变株。所有抗性突变株经进一步固态发酵筛选,获得了4株稳定高产纤溶酶的正突变株Q_1、Q_(18)、Q_(26)和Q_(39),其纤溶酶产量分别比出发菌株提高了32.9%、21.5%、22.3%和18.0%。 以Q_1作为试验菌株,优化了该菌株产纤溶酶固态发酵条件。首先对发酵培养基进行了优化,运用单因素实验、正交实验和均匀设计及响应面分析法研究了不同氮源、不同碳氮比例、不同培养基初始pH、不同培养基加水量及无机盐对根霉产纤溶酶的影响,并确立了培养基各组成成份的最佳水平。进一步采用正交实验对根霉产纤溶酶的发酵时间和接种量进行了优化。根霉12#在优化条件下浅盘发酵平均产酶量为791.81U/g物料,是优化前的产酶量(243.1u/g物料)的3.26倍。 以Q_1作为试验菌株,优化了根霉12#液体发酵产生纤溶酶的培养基组成,研究了产酶的部分机理。通过单因素实验,正交实验,均匀设计和Plackett-Burman等实验,确定根霉液体发酵产生纤溶酶可采用以豆粕和麸皮为主料的两种培养基配方,采用这两种培养基的根霉液体摇瓶发酵纤溶酶活力分别达到182U/ml和140U/ml。胰蛋白胨具有诱导促进根霉产生纤溶酶的作用,豆粕水解物的诱导产酶促进作用效果和胰蛋白胨相当,可以起到替代胰蛋白胨的作用。 对根霉产纤溶酶的制备分离纯化工艺进行了探索和研究,建立了根霉纤溶酶的分离提纯工艺。根霉发酵物经生理盐水浸提、40%-70%硫酸铵分级盐析、Octyl-Sepharose FF疏水相互作用色谱、Q-Sepharose FF离子交换色谱和Sephacryl S-100凝胶过滤色谱处理后,可得到经SDS-PAGE及常规PAGE证明为均一的纤溶酶。 以载量大、制备速度快和容易放大为原则,对根霉产纤溶酶的制备分离提纯流程进行了研究和优化。建立了用阴离子交换树脂对根霉粗纤溶酶液进行脱色的方法,确立了分离提取根霉纤溶酶的制备色谱模式并进行了合理组合,建 摘要 立了优化工艺流程。根霉发酵物浸提液经离子交换树脂脱色、盐析、 Oetyl一Sepharose FF、phenyl一sepharoseHp疏水层析色谱和Sp一sepharose Hp强阳 离子交换色谱后,可得到用高分离度Resource Phe色谱和SDS一PAGE方法检验 证明为均一的纤溶酶。 对纯根霉纤溶酶的性质进行了研究。SDS一PAGE电泳和凝胶过滤方法测定根 霉纤溶酶分子量为18.0 kDa和16.6kDa,表明该酶由单亚基组成。等电聚焦方法 测定该酶等电点8.5士0.1。根霉纤溶酶比活力2143U/mg(尿激酶单位),有直接 降解血纤维蛋白和激活血纤维蛋白溶酶原成纤溶酶的双重溶栓作用;可同时降 解血栓中主要成分纤维蛋白单体的a、p和Y肤链。纤溶酶最适作用温度45℃, 37℃、42℃和47℃分别保温4h,酶活力保持84%、70%和53%,该酶对高温较 为敏感。纤溶酶最适作用pH为9.5,最稳定的pH范围是6.8一8.8,在该pH范围 内37℃保温24h,酶活力保存94%以上,pH稳定性很好;pH大于4.8、小于10.8 范围内酸性和碱性条件引起的酶活性降低可以部分恢复。根霉纤溶酶分解酪蛋 白;实验范围内该酶只作用于N一Succinyl一Ala一Ala一Pr。一Phe一pNA合成生色底物, 不作用于凝血酶、尿激酶和胰蛋白酶的特异性生色底物,底物专一性好;对 N一Succinyl一Ala一Ala一pro一phe一pNA分解的米氏常数为0.226mM,酶反应转换数Kc.:t 为16.36S’’,表明对该底物的亲和性较好,反应速度较高。莫氏试验和甲苯胺 蓝实验证明根霉纤溶酶为糖蛋白,地衣酚一硫酸法测定该酶含糖量为4.71%。 EDTA、pCMB、PMSF对根霉纤溶酶有抑制作用,sBT一、Lys、TPeK、AProtinine 对该纤溶酶无明显的抑制作用。初步判定根霉纤溶酶的活性中心含有琉基和金 属,也可能含有丝氨酸。znZ+、FeZ+、Fe3+、euZ+、MnZ+、、eoZ+离子对根霉纤溶 酶有不同程度的抑制作用,K+、Na+、c扩+、Mg2+离子对酶的活性无明显的作用, 上述金属离子在实验范围内对根霉纤溶酶没有激活作用。纤溶酶液中加入甘油 和蔗糖均能提高酶的稳定性。氨基酸序列分析仪测定的根霉纤溶酶N端12个氨 基酸序列为NHZ一Ser-Val一Se卜Glu一11卜Gln一Leu一Met一His一Asn一Leu一Gly,与其它生物 来源的纤溶酶氨基酸序列比较,没有同源性。
【学位授予单位】:天津科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:TQ925

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