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《天津农学院》 2015年
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共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒的构建及其抑菌效果评价

李萌  
【摘要】:内溶素(virolysin)是噬菌体感染宿主菌后期产生的一种细胞壁水解酶,通过水解宿主菌细胞壁成分间的连接键实现裂解细菌的目的。SAL-2是短尾病毒科金黄色葡萄球菌噬菌体SAP-2产生的一种内溶素,其可以有效移除金黄色葡萄球菌外的生物膜,并对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和血葡萄球菌等多种葡萄球菌具有广谱的抑菌作用。人溶菌酶(Human lysozyme,hLYZ)又名N-乙酰基胞壁酸水解酶,是人体免疫防御的组成部分,其通过水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β,1-4糖苷键而起到裂解细菌的作用。hLYZ对奶牛乳房炎的主要致病菌金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等都具有明显的抑菌作用,还可以加强机体的免疫力,逐渐成为近几年来的研究热点。腺病毒载体(Adenovirus vector,Adv)是目前基因治疗中应用前景最广的一种转基因载体之一,具有高滴度、高效率、不整合入宿主细胞基因组和低致病性等优点。本研究通过扩增和克隆得到共表达SAL-2和hLYZ基因的重组腺病毒,通过检测重组腺病毒在体外的表达和外源蛋白的抑菌作用,为寻求有效防治奶牛乳房炎的基因治疗方案奠定理论和实验基础。本实验分别从金黄色葡萄球菌噬菌体和人乳体细胞扩增得到SAL-2和hLYZ基因,将获得的目的基因克隆至穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1,获得重组穿梭载体。经过菌液PCR、双酶切和测序鉴定结果为阳性的重组穿梭载体线性化,在BJ5183细胞中与Adeasy骨架质粒发生同源重组。重组子通过卡那抗性筛选、Pac I酶切鉴定正确后,将包含目的基因的重组腺病毒质粒分别命名为pAd-SAL、pAd-LYZ、pAd-SAL-LYZ和pAd-GFP。筛选的阳性重组腺病毒质粒经PmeI线性化后,通过脂质体共转法转染HEK293细胞,进行病毒的包装和扩增。收获的重组腺病毒能够感染HEK293细胞并引起细胞病理变化,通过RT-PCR检测到重组腺病毒在细胞内的复制,Western blotting检测外源蛋白在细胞内的表达。通过氯化铯密度梯度离心法纯化扩增得到的重组腺病毒,并利用50%组织培养感染剂量法(TCID_(50))测定病毒滴度,将获得的阳性重组腺病毒分别命名为Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SAL-LYZ和Ad-GFP。重组腺病毒转染细胞后提取细胞总蛋白并检测蛋白浓度,通过纸片法测定蛋白提取液对实验菌株的抑菌效果。测定目的蛋白对实验菌株的最小抑菌浓度后,比较最小抑菌浓度的目的蛋白和抗生素对实验菌株的抑菌效果。实验结果显示:RT-PCR检测证实,携带目的基因的重组腺病毒颗粒成功导入HEK293细胞中;Western blotting检测显示构建的重组腺病毒可表达SAL-2蛋白和hLYZ蛋白;荧光倒置显微镜下观察发现,包装得到的对照重组腺病毒Ad-GFP具有良好的具有良好的感染性,可在细胞中形成病毒颗粒;纯化后得到的病毒颗粒通过TCID_(50)法测定病毒滴度,结果显示,正确构建的重组腺病毒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SAL-LYZ和Ad-GFP的病毒滴度分别为10~8.17.17 TCID_(50)/mL,10~8.50.50 TCID_(50)/mL,10~8.63.63 TCID_(50)/mL和10~(7.60)TCID_(50)/mL,证实含有目的基因的重组腺病毒构建成功,并达到体外实验的病毒滴度;重组腺病毒感染HEK293细胞后提取蛋白,经测定蛋白浓度分别为2.221 mg/mL、1.935mg/m L和3.144 mg/mL;敏感性检测结果显示除大肠杆菌外,其他菌株均对目的蛋白较敏感,共同表达的目的蛋白抑菌效果增强;共表达的蛋白对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳链球菌(ATCC 9809)、无乳链球菌和大肠杆菌(K88)的最小抑菌浓度分别为37.5μg/m L、75μg/mL、150μg/mL、150μg/m L和300μg/m L,最小抑菌浓度的目的蛋白对实验菌株的抑菌效果可以达到甚至超过常用抗生素。本实验利用SAL-2对金黄色葡萄球菌的广谱抑菌效果、hLYZ广泛高效的抑菌作用及不会损伤动物细胞的特性,以及腺病毒载体可以在真核细胞内高效稳定表达外源基因的优势,成功构建共表达SAL-2基因和hLYZ基因的重组腺病毒。构建完成的腺病毒可以在HEK293细胞中有效表达,所表达的蛋白对实验菌株表现出良好的抑菌活性,本研究为临床细菌性疾病的防治提供了新的思路和实验基础。
【学位授予单位】:天津农学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.6

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