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《天津农学院》 2014年
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减毒炭疽芽胞杆菌mntA基因敲除疫苗候选株的构建与评价

刁立鹏  
【摘要】:炭疽是一种由炭疽芽胞杆菌感染引起的人畜共患的烈性传染病。动物炭疽疫苗多以注射方式进行免疫,且每年免疫一次。这种方式免疫动物有很大的不便,且易造成应激。另外现有的疫苗株A16R存在毒性较大的问题。因此有必要研制一种新型的口服减毒炭疽芽胞疫苗。炭疽芽胞杆菌mntA基因编码的MntA蛋白是一种可溶性的ATP依赖的结合锰离子转运载体蛋白,在体外培养和感染宿主的过程中都能够表达,而且mntA蛋白的表达不依赖于毒性质粒pXO1和pXO2。MntA蛋白是一个新型炭疽毒力因子,在炭疽致病过程中发挥重要的作用。MntA缺失突变会导致菌株毒力减弱。本研究的目的是在已有的炭疽芽胞杆菌减毒株AP422和AP429的基础上,敲除毒力基因mntA,使其进一步减毒制备炭疽芽胞杆菌新型减毒活芽胞疫苗候选株,研究新的疫苗候选株的生物学特性,并对其进行安全性和免疫原性评价。利用Cre-LoxP系统,通过同源重组的方法敲除减毒炭疽芽胞杆菌AP422和AP429株的mntA基因,使菌株进一步减毒,构建新的疫苗候选株。利用PCR的方法扩增上下游同源臂后与温敏质粒pMAD::spc连接构建打靶载体并转化减毒炭疽芽胞杆菌AP422和AP429。利用抗生素和温度两种选择压力,实现同源重组,敲除目标基因mntA,然后利用Cre-Loxp系统去除抗性筛选标记,得到无抗性筛选标记的缺失突变株。经PCR鉴定和测序,结果显示mntA基因已经完全缺失,相应位点处只剩下一个loxP位点。Western blot结果表明,缺失突变株mntA蛋白不再表达。研究结果表明:AP422和AP429株的mntA基因已经被成功敲除,获得了无抗性标记的mntA基因缺失突变株AP430。生物学特性研究,出发菌株和重组菌株的每个小时测得的OD_(600)值基本一致,这表明它们的生长速度基本一致,因此生长能力基本一致,重组菌的芽胞形成能力良好,在LB培养基中培养,37℃、250 rpm、培养96 h的条件下就能充分形成芽胞,浓缩后芽胞的浓度可达到10~9 CFU/mL,可用于动物试验。利用共培养的方式进行的生存能力竞争试验,它们第一代时两者的生存比例为1.50、1.30,但当传到第四代时,只有出发菌生长,无重组菌生长,这一试验结果表明出发菌株较重组菌株有明显的生长优势,重组菌的生存能力降低。用制备好的A16R和AP430芽胞给8周龄的C57小鼠进行左下肢肌肉注射,观察疫苗候选株的的安全性。结果表明,当注射的剂量为2.5×10~8 CFU/只时,注射A16R芽胞组的小鼠全部左下肢及腹部水肿,第二天死亡4/7,第三天又死亡2/7;当注射的剂量为2.5×10~7CFU/只时,注射A16R芽胞组的小鼠全部左下肢及腹部水肿,在第三天小鼠死亡4/7。但是在这两个剂量下注射AP430芽胞组的小鼠,精神状态和运动状态良好,无水肿,无死亡,表明AP430的毒力大大降低。用制备好的A16R和AP430芽胞口服免疫250g左右的雌性豚鼠。AP430芽胞试验组结果表明,剂量为2×10~8CFU/只组的ELISA OD_(450)值为0.8左右,剂量为2.0×10~7 CFU/只组的OD_(450)值为0.7左右;A16R对照组的相应抗体ELISA OD_(450)检测值分别为0.70、0.55。AP430芽胞2.0×10~8 CFU剂量组,在小肠液未稀释时检测其PA sIgA,ELISA检测OD_(450)值为0.90左右,2.0×10~7CFU剂量组OD_(450)值为0.80左右,A16R对照组的相应抗体检测值为0.75、0.68左右。新构建获得的减毒炭疽芽胞杆菌mntA基因缺失突变株实现了进一步减毒,有望成为炭疽芽胞杆菌新的疫苗候选株。
【学位授予单位】:天津农学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S852.61

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