收藏本站
《天津农学院》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

番茄果实转录因子CNR的原核表达与纯化及抗体制备

白娟娟  
【摘要】:Colourless non-ripening(cnr)番茄是一种典型的果实成熟突变体,这种突变主要是由于在番茄突变体cnr中LeSPL-CNR启动子上游有一段286 bp序列的胞嘧啶甲基化程度特别高,导致DNA甲基化的改变,但核酸序列没有差异。目前,关于番茄转录因子CNR的研究主要在转录水平,然而蛋白合成后存在翻译后水平的修饰,蛋白水平才是转录因子CNR发挥作用的水平。本研究通过番茄转录因子CNR的原核表达及纯化、多克隆抗体的制备,在蛋白水平上研究番茄转录因子CNR。主要研究结果如下:(1)pET-CNR原核表达载体的构建:根据GenBank中已发表的番茄CNR基因的序列设计引物,用于CNR基因的扩增。以番茄总RNA为模板,反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行CNR基因扩增,获得与预期CNR编码基因大小相符的片段。将该片段和表达载体pET-30a用限制性内切酶BamHI和XhoI切成双黏性末端,纯化后均用T_4连接酶进行定向连接,并转入大肠杆菌感受态Rosetta进行表达。通过测序确定pET-CNR重组载体具有正确的编码框,且测序结果与已发表番茄CNR编码序列完全一致,初步证明了原核表达载体pET-30a-CNR初步构建成功;再通过IPTG诱导进行小量表达,结果分析在27kD处有CNR蛋白表达,证明pET-30a-CNR可以表达蛋白,pET-CNR原核表达载体构建成功。(2)CNR蛋白在大肠杆菌中的原核表达及纯化:挑取含有重组质粒pET-CNR的固体培养基中的单个阳性菌落至培养基中培养,以IPTG为诱导剂进行诱导,IPTG诱导剂的诱导浓度分别为0.1、0.4、0.8和1.0mmol/L,37℃培养,3h后分别收集菌体,超声波裂解,分别保留上清和沉淀,用12%SDS-PAGE分析蛋白表达情况,确定了IPTG诱导剂诱导的最佳浓度为1.0mmol/L,诱导表达后的CNR蛋白在菌体裂解液的上清液中大量表达,而在菌体裂解液的沉淀中几乎没有表达。因此,直接将上清液经0.22μm滤膜过滤后加入Ni亲和层析柱中进行纯化,收集咪唑浓度500mmol/L洗脱缓冲液洗脱下来的蛋白,每管收集200μl,采用BCA试剂盒法分别对每管收集的蛋白进行定量分析,将蛋白浓度大于1mg/ml的收集管中的蛋白混合,测总蛋白浓度,用于抗体的制备。(3)CNR蛋白多克隆抗体的制备:将100μg纯化后的CNR蛋白与弗氏完全佐剂按1:1混合乳化,小鼠腹部皮下4-6点免疫,再做3次加强免疫,在最后1次免疫后10d采集小鼠全血。免疫血清在4℃下静置过夜,5000rpm离心10min,取上清液,然后进行分装,分别用于血清效价的测定以及蛋白免疫印迹实验,得到了效价较高的多克隆抗体。通过提取不同时期番茄果实的总蛋白进行免疫印迹,结果表明转录因子CNR在番茄果实的破色期起很重要的作用。
【学位授予单位】:天津农学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S641.2;Q943.2

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 邵旭日;韩莹琰;齐长红;田雅楠;范双喜;;叶面施用不同浓度的硒肥对番茄果实品质的影响[J];蔬菜;2017年08期
2 罗晶;谭新球;杜生明;;我国科学家发现番茄果实苹果酸代谢调控的新机制[J];中国科学基金;2017年05期
3 王晓琳;曹东艳;董今;田慧琴;朱本忠;;番茄果实成熟突变体的研究进展[J];中国生物工程杂志;2016年01期
4 邢亚莉;史才雪;李汉霞;叶志彪;;番茄果实角质层的形成机理[J];园艺学报;2016年09期
5 赵瑞平;何扩;白殿海;孙丰梅;;高压静电场处理对番茄果实脂肪酸变化的影响[J];食品科技;2015年05期
6 ;如何预防番茄生理性裂果[J];农业知识;2017年17期
7 代顺冬;牛晓丽;胡田田;周振江;;水肥供应对番茄果实可溶性糖含量的影响[J];节水灌溉;2013年03期
8 王俊玲;李晓峰;王梅;高志奎;霍捷;;光质对番茄果实表面光系统活性的影响[J];华北农学报;2012年01期
9 秦公伟;曹小勇;陈德经;殷荷兰;党文娟;;多个番茄果实样品脂肪酸含量及组成比较分析[J];食品工业科技;2012年15期
10 鲁少尉;齐飞;李天来;;盐胁迫对番茄果实糖含量及蔗糖代谢的影响[J];中国蔬菜;2012年20期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 朱为民;李锋;;番茄果实裂性与耐压性[A];中国园艺学会首届青年学术讨论会论文集[C];1994年
2 石正强;沈火林;;营养液电导度的增加和不同栽培基质对温室番茄果实中抗氧化物质含量的影响[A];中国园艺学会第五届青年学术讨论会论文集[C];2002年
3 王楠;崔娜;张佳楠;范海延;李天来;;茉莉酸信号对不同发育时期番茄果实中糖含量的影响[A];中国园艺学会2013年学术年会论文摘要集[C];2013年
4 张佳楠;崔娜;王楠;范海延;李天来;;外源茉莉酸甲酯对不同发育时期番茄果实糖含量的影响[A];中国园艺学会2013年学术年会论文摘要集[C];2013年
5 王艳;张其安;方凌;田红梅;严从生;江海坤;王明霞;;不同颜色番茄果实转色期相关酶活性的研究[A];中国园艺学会2013年学术年会论文摘要集[C];2013年
6 杨丽丽;王一鸣;董乔雪;;温室番茄果实动态生长模型研究与实现[A];中国农业工程学会电气信息与自动化专业委员会、中国电机工程学会农村电气化分会科技与教育专委会2010年学术年会论文摘要[C];2010年
7 王昕;李建桥;任露泉;;番茄果实采收后的硬度测定及其变化规律[A];农业机械化与全面建设小康社会——中国农业机械学会成立40周年庆典暨2003年学术年会论文集[C];2003年
8 王昕;李建桥;任露泉;;番茄果实采收后的硬度测定及其变化规律[A];中国农业机械学会成立40周年庆典暨2003年学术年会论文集[C];2003年
9 牟咏花;黄建中;;钙和钙调素与番茄果实脐腐病的关系[A];中国园艺学会首届青年学术讨论会论文集[C];1994年
10 张红星;朱本忠;谢远宏;杨祥龙;张文;罗云波;;番茄乙烯信号转录因子LeERF1基因克隆和蛋白表达[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 果志华 于朋;少摘重养 番茄果实周围的叶片这样摘[N];农业科技报;2019年
2 本报记者 蒋建科;想吃啥样的西红柿?“编辑”吧![N];人民日报;2017年
3 三河市农业技术推广总站 刘艳平;番茄果实异常的原因及防治[N];河北科技报;2012年
4 吴荣美;改善栽培条件减少番茄筋腐果发生[N];江苏农业科技报;2018年
5 隋志丹;番茄筋腐果多发 教你三招轻松搞定[N];农业科技报;2019年
6 隋志丹;三招防治番茄筋腐果[N];山东科技报;2019年
7 平乡县农业农村局 刘丽君;防治番茄筋腐果三措施[N];河北科技报;2019年
8 张静;四项举措 让秋茬番茄着色均匀[N];农业科技报;2019年
9 吕福堂;番茄果实的生理病害及防治[N];北京科技报;2003年
10 王艳;番茄裂果原因多[N];江苏农业科技报;2018年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 叶杰;全基因组关联分析挖掘调控番茄果实苹果酸积累的关键基因[D];华中农业大学;2015年
2 孟兰环;转录因子SlBEL11调控番茄果实叶绿素代谢和成熟的分子机制研究[D];中国农业大学;2018年
3 冯超阳;番茄果实糖代谢中关键SlSWEETs基因的鉴定及其功能验证[D];沈阳农业大学;2018年
4 李家寅;生长素及生长素-乙烯互作调控番茄果实成熟的效应与机理[D];浙江大学;2017年
5 孙宇飞;脱落酸代谢途径与信号转导关键基因调控樱桃和番茄果实成熟分子机制的研究[D];中国农业大学;2017年
6 王孝宣;增强番茄果实颜色基因的精细定位及相关基因的差异表达[D];中国农业科学院;2004年
7 王昕;番茄常温可食涂膜保鲜的理论与方法[D];吉林大学;2004年
8 张红星;番茄中乙烯信号转录因子LeERF1和LeERF2调控机制研究[D];中国农业大学;2005年
9 傅达奇;番茄中病毒诱导基因沉默体系的建立及LeEIN2基因功能分析[D];中国农业大学;2005年
10 张俊红;番茄Aux/IAA基因的克隆与功能分析[D];华中农业大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈强;猕猴桃AcPDS1基因对番茄果实品质的影响[D];合肥工业大学;2019年
2 白娟娟;番茄果实转录因子CNR的原核表达与纯化及抗体制备[D];天津农学院;2018年
3 赵雅楠;番茄NAC转录因子与脱落酸、乙烯的关系研究[D];天津大学;2018年
4 唐培培;SlRCHY1和SlPL在番茄果实发育及成熟过程中的功能研究[D];郑州大学;2019年
5 刘丹;利用番茄果实泛转录组挖掘抗性及可溶性固形物含量相关基因[D];西北农林科技大学;2019年
6 袁亚钦;SlAS2和SlTKN3调控番茄果实发育的功能研究[D];中国农业科学院;2019年
7 李婷婷;H_2S和CAS调控番茄果实采后抗氧化信号机制及CAS功能研究[D];合肥工业大学;2018年
8 孙克克;H_2S/OASTL调节番茄果实采后贮藏品质的生理机制研究[D];合肥工业大学;2018年
9 马小锐;番茄果实代谢组学研究方法的建立及MQTLS的预测[D];华中农业大学;2018年
10 王沙沙;H_2S和D/L-CD调节番茄果实成熟衰老的生理机制研究[D];合肥工业大学;2018年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026