番茄果实转录因子CNR的原核表达与纯化及抗体制备

【摘要】：Colourless non-ripening(cnr)番茄是一种典型的果实成熟突变体,这种突变主要是由于在番茄突变体cnr中LeSPL-CNR启动子上游有一段286 bp序列的胞嘧啶甲基化程度特别高,导致DNA甲基化的改变,但核酸序列没有差异。目前,关于番茄转录因子CNR的研究主要在转录水平,然而蛋白合成后存在翻译后水平的修饰,蛋白水平才是转录因子CNR发挥作用的水平。本研究通过番茄转录因子CNR的原核表达及纯化、多克隆抗体的制备,在蛋白水平上研究番茄转录因子CNR。主要研究结果如下:(1)pET-CNR原核表达载体的构建:根据GenBank中已发表的番茄CNR基因的序列设计引物,用于CNR基因的扩增。以番茄总RNA为模板,反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行CNR基因扩增,获得与预期CNR编码基因大小相符的片段。将该片段和表达载体pET-30a用限制性内切酶BamHI和XhoI切成双黏性末端,纯化后均用T_4连接酶进行定向连接,并转入大肠杆菌感受态Rosetta进行表达。通过测序确定pET-CNR重组载体具有正确的编码框,且测序结果与已发表番茄CNR编码序列完全一致,初步证明了原核表达载体pET-30a-CNR初步构建成功;再通过IPTG诱导进行小量表达,结果分析在27kD处有CNR蛋白表达,证明pET-30a-CNR可以表达蛋白,pET-CNR原核表达载体构建成功。(2)CNR蛋白在大肠杆菌中的原核表达及纯化:挑取含有重组质粒pET-CNR的固体培养基中的单个阳性菌落至培养基中培养,以IPTG为诱导剂进行诱导,IPTG诱导剂的诱导浓度分别为0.1、0.4、0.8和1.0mmol/L,37℃培养,3h后分别收集菌体,超声波裂解,分别保留上清和沉淀,用12%SDS-PAGE分析蛋白表达情况,确定了IPTG诱导剂诱导的最佳浓度为1.0mmol/L,诱导表达后的CNR蛋白在菌体裂解液的上清液中大量表达,而在菌体裂解液的沉淀中几乎没有表达。因此,直接将上清液经0.22μm滤膜过滤后加入Ni亲和层析柱中进行纯化,收集咪唑浓度500mmol/L洗脱缓冲液洗脱下来的蛋白,每管收集200μl,采用BCA试剂盒法分别对每管收集的蛋白进行定量分析,将蛋白浓度大于1mg/ml的收集管中的蛋白混合,测总蛋白浓度,用于抗体的制备。(3)CNR蛋白多克隆抗体的制备:将100μg纯化后的CNR蛋白与弗氏完全佐剂按1:1混合乳化,小鼠腹部皮下4-6点免疫,再做3次加强免疫,在最后1次免疫后10d采集小鼠全血。免疫血清在4℃下静置过夜,5000rpm离心10min,取上清液,然后进行分装,分别用于血清效价的测定以及蛋白免疫印迹实验,得到了效价较高的多克隆抗体。通过提取不同时期番茄果实的总蛋白进行免疫印迹,结果表明转录因子CNR在番茄果实的破色期起很重要的作用。

【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S641.2;Q943.2