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《天津农学院》 2018年
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高粱WIN1基因特有RNA剪接方式及其相应转录本的生物学功能研究

郝近羽  
【摘要】:截止2017年,我国高粱种植面积已达1500万亩,其中高粱生产主要以粒用高粱为主。高粱抽穗后叶片和茎秆叶鞘表面会出现大量肉眼可见的白色粉霜状结构,称其为蜡质,高粱丰富的内嵌蜡质结构和外层表皮蜡质可以防止水分散失,保护高粱免受不同环境胁迫的伤害,进而提高其抗旱、抗虫、耐贫瘠等特性,使高粱产量得到大幅提升。为充分挖掘和利用高粱的抗旱遗传潜势,本研究深入分析了高粱蜡质基因的作用机理,以期将抗旱基因和抗旱功能紧密联系起来。本试验根据在田间测定的蜡质含量结果,以高粱保持系BTx622为材料,进行转录组学分析,并分别克隆了高粱蜡质相关基因SbWIN1的全长转录本SbWIN1-204及特有剪接转录本SbWIN1-27,在模式植物拟南芥和高粱中构建了过表达载体并且对转基因植物进行了研究。主要试验结果如下:1、不同类型高粱茎秆蜡质含量变化规律研究采用色差法对高粱蜡质进行测定。不同类型高粱之间茎秆的蜡质含量有明显的差异,粒用高粱BTx622蜡质含量最高;饲草高粱茎秆自上而下各节段的蜡质含量呈现出高-低-高的变化趋势;不同类型高粱在同一生育时期内蜡质累积量不同,饲草高粱为抽穗期开花期乳熟期蜡熟期完熟期,甜高粱为乳熟期抽穗期开花期蜡熟期完熟期;不同类型高粱在同一个生育时期内蜡质日变化呈单峰曲线,蜡质含量的峰值出现在13:00时。2、高粱不同器官的转录组学分析利用Illumina HiSeq 4000测序平台,对粒用高粱BTx622的六大器官(根、茎、叶、叶鞘、小穗和幼苗)进行转录组测序以及生物信息学分析。转录组测序获得321 790 986条原始测序序列(Raw reads),过滤后获得311 985 466条序列(Clean reads);共鉴定出37 310个基因及469 601个可变剪接事件。在分析可变剪接的过程中发现,蜡质相关基因SbWIN1共存在7种可变剪接序列,除全长转录本外,均属于第一个外显子可变剪接(TSS)和最后一个外显子可变剪接(TTS)。其中,全长转录本编码204个氨基酸(命名为SbWIN1-204),而最短的转录本仅编码27个氨基酸(命名为SbWIN1-27)。3、高粱WIN1基因不同剪接转录本的分离及生物学功能鉴定为进一步探究SbWIN1基因两种转录本之间的异同,分别对其进行克隆并通过Gateway技术构建了含有EGFP的过表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥和高粱并进行相关功能鉴定。SbWIN1-204和SbWIN1-27转录本均含有AP2保守结构域,属于AP2家族,在高粱的六大器官中也有不同程度的表达,在茎中表达量最高;荧光显微镜下观察EGFP转基因拟南芥发现,SbWIN1-204仅在细胞核中有荧光现象,而SbWIN1-27在细胞的各个部位均有荧光现象;通过扫描电镜进一步观察发现,与野生型植物的蜡质相比,转基因植物表皮蜡质明显增加,抗旱性也大幅提高,但SbWIN1-204转基因植物的蜡质含量略高于SbWIN1-27,表明SbWIN1基因对蜡质合成途径起到正调控作用。利用农杆菌介导法探究高粱转基因体系,以高粱的幼穗和幼胚作为外植体,发现忻梁52和三尺三品种的分化率较高,可获得少量抗性愈伤组织,但均未分化出转基因苗,全部褐变致死。
【学位授予单位】:天津农学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S514;Q943.2

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