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《天津医科大学》 2012年
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胶原/丝素纳米纤维材料肝细胞培养与多功能生物人工肝研究

胡玮  
【摘要】:人工肝主要分为非生物型人工肝、生物型人工肝。生物反应器是生物人工肝支持系统的核心部分,其性能直接关系到人工肝支持的效率和效果,生物反应器设计必须满足两个基本功能,一是为肝细胞提供良好的生长、代谢环境;二是为肝衰竭患者血液或血浆与肝细胞作用,进行物资交换提供理想的场所。体外肝细胞理想的培养条件应尽可能模拟体内肝细胞生长微环境,天然细胞外基质的胶原蛋白纤维尺寸为50~500nm.因此纳米尺度、具有合适的孔尺寸、高孔隙率支架能最大程度地仿生体内细胞外基质的特点。 静电纺丝技术制备的纳米级材料比表面积大、孔隙率高,纳米纤维支架与细胞外基质在形态结构上非常相似,作为组织工程支架材料不仅能够起到支撑细胞的作用,还能发挥模板功能,为细胞提供黏附、生长、分化和增殖的场所。 本研究采用静电纺丝的方法,制备胶原/丝素电纺纳米纤维膜,观察其对肝细胞体外培养的作用,为其在人工肝生物反应器中的应用提供理论依据;同时设计完成制作多功能生物人工肝支持系统,使其既具备血浆置换、血液灌流、血液滤过、血液透析、连续性血液透析滤过、白蛋白透析等非生物人工肝功能,又能与生物反应器配合使用,具备生物型人工肝功能。 研究内容如下: 1,以HFIP为溶剂,以胶原蛋白、丝素蛋白为材料,通过静电纺丝方法制备人工肝支架,研究静电纺丝的参数设定,并对材料进行物理、生物性能鉴定,主要包括交联后材料表面、交联特性、力学特性等;同时进行大鼠皮下植入实验,考察材料生物学性能。 2,分离提取新鲜大鼠原代肝细胞,以胶原/丝素电纺纳米纤维膜作为基底材料进行体外肝细胞培养,考察肝细胞在材料界面上生长增殖情况。 3,用已经成熟的肝细胞系HepG2细胞进行胶原/丝素电纺纳米纤维支架材料体外肝细胞培养,考察已经成熟的肝细胞株在材料界面上的生长情况。 4,通过超声振荡方法制备胶原/丝素纳米纤维微载体,将微载体与胶原凝胶细胞培养技术结合,观察纳米纤维载体/胶原凝胶复合体系对肝细胞体外培养的作用。 5,按照三重循环方式设计多功能生物人工肝支持系统,划分出功能单元分模块进行设计。进行样机制作,制定产品标准,完成样机检测。 研究结果显示: 1,以HFIP为溶剂,在溶液浓度为10%,电压为16kV,喷速为2ml/h,接收距离为12cm的条件下,胶原蛋白与再生丝素比例分别为10:0,7:3,5:5,3:7,0:10,电纺五种配比的胶原/丝素溶液,制备的复合纤维直径在550-1100nm之间,其中纯胶原和纯丝素的纤维平均直径分别为569±99nm和1058±240nm,纤维平均直径随着丝素含量的增加而增加。 2,大鼠原代肝细胞培养结果显示,常规培养组在第二天细胞数量与细胞功能达到高峰,之后迅速下降,而胶原/丝素纳米纤维支架组在第二天达到高峰后,之后3-5天内维持平稳缓慢下降状态,其尿素合成、蛋白分泌与常规培养组有明显差别。 3, HepG2细胞培养结果显示细胞在材料表面生长状态良好并与支架材料紧密结合。随培养时间延长,常规培养组细胞在第5天后逐渐死亡,失去细胞功能,胶原/丝素纳米纤维支架组细胞在4-9天内能够维持稳定状态,其尿素合成、蛋白分泌与常规培养组有明显差别,其中丝素含量为50%组的细胞状态和细胞功能高于其它组。 4,纳米纤维载体/胶原凝胶复合培养观察结果显示,培养12d,纳米纤维载体/胶原凝胶复合培养组白蛋白分泌功能稳定,持续增高,于第9天达到峰值,之后缓慢下降;而胶原凝胶培养组培养液中白蛋白含量至第3天达到峰值,之后迅速下降,至第6天大部分细胞死亡,失去白蛋白分泌功能。镜下观察纳米纤维载体/胶原凝胶复合培养组细胞聚集于纳米纤维载体周围生长,形成聚集体,细胞维持稳定状态至12d;胶原凝胶培养组中细胞均匀分布,至培养第3天细胞数量到达峰值,之后细胞逐渐萎缩死亡。 5,多功能生物人工肝设计图、产品标准见文章第三部分。 综上所述,采用静电纺方法能够制备出纳米级别胶原/丝素复合纤维膜,而肝细胞在胶原/丝素电纺纳米纤维膜表面贴附牢固,生长状态良好并维持功能,部分细胞向膜材料表面孔径内迁移,较之常规培养细胞增殖效果明显,维持功能表达时间延长,丝素含量为50%组细胞活性最好,电纺胶原/丝素纳米纤维制备成微载体后,与胶原凝胶培养方式结合,能够进一步增强细胞培养功能,复合培养组细胞围绕微载体聚集生长,形成细胞聚集体,依附于微载体上肝细胞微囊包载体肝细胞形态,12d培养周期内细胞生长状态良好,12d后依然维持三维形态,细胞形态良好。胶原/丝素纳米纤维材料有望用于改善人工肝生物反应器中的细胞活性,维持细胞功能表达。多功能生物人工肝支持系统,既具备多种非生物人工肝功能,又能与生物反应器配合使用,具备生物型人工肝功能。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R318.1

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