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《天津医科大学》 2013年
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免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓造血细胞膜靶抗原的研究

丁凯  
【摘要】:目的: 1.检测免疫相关性全血细胞减少症(immuno-related pancytopenia, IRP)患者自身抗体IgG在骨髓造血细胞膜上的作用靶点,探索IRP患者造血细胞膜上可能的靶抗原成分,为进一步纯化和克隆IRP患者自身抗原提供依据。2.检测已发现的红系膜抗原促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor, EPOR)在树突状细胞(dendritic cell, DC)上的表达,以期初步验证IRP中抗原呈递的过程。 方法: 1.研究对象为32例初治IRP患者作为实验组,15例再生障碍性贫血(AA)患者作为病例对照组及15名正常健康者作为对照。FCM检测骨髓造血细胞膜抗体,提取细胞膜蛋白,同时使用辛酸法+盐析法提纯骨髓上清液中的IgG,然后使用免疫印迹法检测IRP患者骨髓上清液中自身抗体IgG的阳性率,进而应用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹法分离和鉴定IRP患者自身抗体IgG在细胞膜上的靶抗原,并与正常对照及病例对照组进行对比;选取目标蛋白条带进行高压液相串联质谱(LC-MS/MS)分析以确定靶抗原成分。并对所鉴定出的部分蛋白成分检测其在造血细胞膜上的异常表达。 2.研究对象为39例骨髓有核红细胞抗体阳性(GlycoA+)患者、30例GlycoA-患者、及17名正常健康者作为对照。使用FCM检测骨髓DC细胞胞膜及胞浆中EPOR的表达,并进行统计学分析,进一步使用RT-PCR的方法检测不同组病例骨髓除红系后造血细胞中EPOR的mRNA表达的差异。 结果: 1. IRP患者组骨髓上清液中IgG的阳性率为50%(16/32),明显高于病例对照组(0%)和正常对照组(13%,2/15)(均P0.01)。在32例初治IRP患者中,其骨髓造血细胞膜上共有两种蛋白成分可被自身抗体IgG识别,其相对分子量分别为72-95kDa及55kDa,阳性率分别为56.25%(9/16)和31.25%(5/16)。切割蛋白条带进行高压液相串联质谱分析,发现乳铁蛋白和WD重复序列蛋白两种膜蛋白成分,其中乳铁蛋白第121位精氨酸存在替代点突变,被丝氨酸或天门冬氨酸所取代。正常对照组10-25kDa蛋白条带未鉴定成功。进一步检测乳铁蛋白在有核红细胞膜上的表达。GlycoA+组患者骨髓有核红细胞乳铁蛋白的平均阳性率为13.44±3.53%,明显高于GlycoA组患者的3.22±2.32%(P0.001)及正常对照组的0.54±0.48%(P0.001),后两者之间亦存在明显差异(P0.05)。 2. EPOR在骨髓DC细胞中的表达。 a) GlycoA+组与GlycoA进行比较。 i.DCl细胞膜上EPOR的表达,GlycoA+组表达率1.45±5.45%与GlycoA-组表达率9.89±4.03%及正常对照组表达率1.06±2.06%无明显差异,而后两者之间存在统计学差异(P=0.016)。DC1胞浆中EPOR的表达,GlycoA+组表达率24.67±31.15%,明显高于GlycoA组表达率8.45±3.04%(P0.05)及正常对照组表达率12.45±28.46%(P=0.001),后两者之间无统计学差异。 ii.DC2细胞膜上EPOR的表达,GlycoA+组表达率10.47±5.26%,明显高于正常对照组表达率0.94±2.67%(P0.05),与GlycoA-组表达率13.23±7.27%无明显差异。DC2胞浆中EPOR的表达,GlycoA+组表达率30.85±11.20%,明显高于GlycoA组表达率15.44±6.53%(P0.05)及正常对照组表达率10.34±4.88%(P=0.001),后两者之间亦有明显差异差异(P0.05)。 b)使用上述数据对两实验组进行组内DC1与DC2的比较、 ⅰ. GlycoA+组,DC1与DC2胞膜EOPR表达率均明显低于胞内(P均0.05)。DC2细胞EPOR表达率无论在细胞膜上还是在胞浆中均明显高于DC1细胞的表达(P0.05)。 ⅱ. GlycoA组DC1与DC2的EPOR胞膜胞浆上的表达均无明显差异。 c)骨髓去除红系后细胞,三组EOPR的mRNA均未见表达。 结论: 1.IRP患者骨髓上清液中存在自身抗体IgG,可作用于骨髓细胞膜上多个靶抗原成分,乳铁蛋白及WD重复序列蛋白就是其中两种可能的抗原,且部分乳铁蛋白存在第121为精氨酸序列的替代点突变,被丝氨酸或天门冬氨酸所替代。另外IRP患者的有核红细胞膜上的确存在本不定位于其细胞膜的乳铁蛋白的异常表达。 2. GlycoA+的IRP患者其DC2细胞胞浆中存在EPOR的异常表达,与其细胞膜表达并不匹配,可能是早期呈递EPOR作为IRP患者造血细胞靶抗原的关键细胞。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R559

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