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肿瘤细胞中铁输出蛋白ferroportin异常调控的机制研究

陈岳  
【摘要】:目的 探讨ferroportin异常表达在前列腺癌和乳腺癌细胞增殖中的作用,并进一步明确其调节的分子机制。 方法 通过qRT-PCR和Western blot检测ferroportin在乳腺癌组织中的mRNA和蛋白表达水平,构建ferroportin高表达质粒,应用ferroportin高表达质粒和ferroportin特异性shRNA转染前列腺癌PC3细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞,建立ferroportin稳定高、低表达的肿瘤细胞系,运用细胞计数、MTT和BrdU等方法检测ferroportin异常表达对肿瘤细胞增殖的影响,克隆形成实验检测其对肿瘤形成能力的作用,并通过构建肿瘤动物模型对体外实验结果进行验证;为了探讨ferroportin异常表达的转录调节机制,我们通过文献检索、网络软件和基因芯片等手段,对ferroportin启动子3.0kb区域进行预测并选定Nrf2和MZF-1作为研究对象,应用染色质免疫共沉淀技术检测Nrf2、MZF-1与ferroportin启动子的相互作用,然后构建含有或不含Nrf2、MZF-1结合位点的luciferase报告基因质粒,通过luciferase报告基因实验分析不同结合位点在转录调节ferroportin表达中的作用,并运用组织筛查和特异性siRNA沉默技术,对结果进一步验证;我们应用MZF-1高表达质粒和MZF-1特异性siRNA转染PC3细胞,通过细胞计数、MTT. BrdU和细胞活力检测等方法检测MZF-1异常表达对肿瘤细胞增殖的影响,然后利用网络工具分别对MZF-13'UTR区域和启动子3.0kb区域进行预测,寻找可能的miRNAs和转录因子;miR-492mimic转染PC3细胞后,细胞计数、MTT和BrdU检测细胞增殖能力,Weste rn blot检测MZF-1蛋白表达水平,构建MZF-13'UTR的luciferase报告基因质粒,通过luciferase报告基因实验分析miR-492对MZF-1的调节;我们利用AP4、c-Myb特异性siRNA技术,通过qRT-PCR和Western blot检测MZF-1的mRNA和蛋白表达水平,然后应用染色质免疫共沉淀实验明确AP4、c-Myb对MZF-1的转录调节作用。 结果 Ferroportin在乳腺癌组织中明显低表达,且ferroportin低表达与乳腺癌的预后不良密切相关。Ferroportin高、低表达的PC3细胞和MDA-MB-231细胞的胞内铁水平相应降低或升高,ferroportin低表达明显促进了PC3细胞和MDA-MB-231细胞的体内外增殖和克隆形成能力;相反,上调ferroportin表达水平后,PC3和MDA-MB-231细胞的体内外增殖及克隆形成能力受到了明显抑制。Ferroportin启动子上确实存在Nrf2的结合位点(-2,656/-2,647),Nrf2可转录调节ferroportin的表达。MZF-1可与ferroportin启动子上的3个位点结合,其中的一个结合位点(-463/-458)在MZF-1转录调节ferroportin表达中发挥主要作用。Nrf2和MZF-1均在恶性肿瘤中明显低表达,与ferroportin表达水平相一致,MZF-1高、低表达后ferroportin蛋白表达水平相应增加或减少。MZF-1低表达可促进前列腺癌PC3细胞的增殖,而上调MZF-1的表达明显抑制了PC3细胞的体外增殖。肿瘤中MZF-1的低表达可通过转录因子和miRNA进行调节,miR-492高表达可促进PC3细胞的体外增殖,miR-492高表达后MZF-1蛋白表达水平明显降低,miR-492可通过靶向干扰MZF-1的3'UTR来实现对MZF-1的调节。另一方面,转录因子AP4和c-Myb可结合到MZF-1的启动子上而转录调节MZF-1的表达,特异性siRNA降低内源性AP4和c-Myb水平可以下调MZF-1的表达水平。 结论 铁输出蛋白ferroportin低表达明显促进了PC3细胞和MDA-MB-231细胞的体内外增殖能力;肿瘤中Nrf2和MZF-1可转录调节ferroportin的表达水平;MZF-1低表达可促进前列腺癌PC3细胞的增殖;miR-492可通过靶向结合MZF-1的3'UTR区域而抑制MZF-1的表达;另外,转录因子AP4和c-Myb可转录激活MZF-1的表达水平。


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