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《天津医科大学》 2014年
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异常甲基化和乏氧对食管鳞癌细胞中BNIP3表达的影响

张洪典  
【摘要】:目的: Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相关蛋白3(BNIP3)作为一种线粒体促凋亡蛋白,在不同肿瘤及肿瘤发展的不同阶段,其表达和功能不尽相同,本课题组前期研究发现,BNIP3在食管鳞癌组织中的表达明显低于正常食管黏膜组织,但其表达下调的具体机制尚未明确。本研究以食管鳞癌细胞株为研究对象,研究BNIP3在食管鳞癌细胞株中的表达情况,进一步探讨启动子区DNA甲基化和组蛋白H3-K9甲基化对BNIP3表达的影响,明确BNIP3表达的表观遗传学调控机制;乏氧环境下培养细胞,探讨乏氧与沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对食管鳞癌细胞中BNIP3表达的影响。 方法: 1.收集食管鳞癌细胞株(KE4、Kyse-140、Caes-17和TE-7),采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测BNIP3mRNA和蛋白表达水平,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测BNIP3启动子区甲基化状态,明确食管鳞癌细胞株中BNIP3表达与基因甲基化的对应关系。同时筛选出BNIP3非甲基化表达的食管鳞癌细胞株和BNIP3高甲基化表达较弱或缺失的食管鳞癌细胞株。 2.应用DNA甲基化酶抑制齐5-Aza-CdR处理BNIP3高甲基化的食管鳞癌细胞株,采用RT-PCR、Western blot和MSP分别检测BNIP3在5-Aza-CdR处理前后的食管鳞癌细胞株中的表达及其启动子区甲基化情况,明确食管鳞癌中BNIP3表达的甲基化调控机制。 3.应用染色体免疫沉淀技术(ChIP)比较5-Aza-CdR处理前后因甲基化状态改变而重新被激活的食管鳞癌细胞株中组蛋白H3-K9甲基化与BNIP3表达水平的关系,揭示组蛋白H3-K9甲基化修饰对食管鳞癌中BNIP3表达的调控机制。 4.MIC-101乏氧培养系统模拟肿瘤乏氧微环境,荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Western blot检测常氧、乏氧(1%O2)及siRNA沉默HIF-1α后食管鳞癌细胞株中BNIP3mRNA和蛋白表达水平的变化,明确乏氧对食管鳞癌细胞中BNIP3表达的影响。 结果: 1. RT-PCR和Western blot显示:BNIP3mRNA和蛋白在KE4和Caes-17细胞株中高水平表达,而在Kyse-140和TE-7细胞株中表达较弱;同时MSP显示:在Kyse-140和TE-7细胞中BNIP3启动子区发生了明显的甲基化。 2.经5-Aza-CdR处理Kyse-140和TE-7两个细胞株后,BNIP3启动子区甲基化状态得到了逆转,同时其表达水平显著升高。 3.在Kyse-140细胞中,BNIP3表现为组蛋白H3-K9甲基化、DNA甲基化和BNIP3低表达;经5-Aza-CdR处理后,BNIP3的组蛋白H3-K9甲基化状态降低(P0.05)、DNA甲基化状态逆转、表达水平升高。 4.缺氧条件下,BNIP3非甲基化的Caes-17细胞中BNIP3mRNA和蛋白的表达水平较常氧时显著升高(P0.05),HIF-1α-siRNA转染Caes-17细胞后能显著下调HIF-1α的表达(抑制率90%),并导致BNIP3的表达受到明显的抑制(P0.05)。 5.缺氧条件下,BNIP3高甲基化的Kyse-140细胞中,经5-Aza-CdR处理前, BNIP3mRNA和蛋白的表达较常氧组无明显升高(P0.05);经5-Aza-CdR处理后,乏氧组BNIP3mRNA和蛋白的表达较常氧组显著升高(P0.05),HIF-1α-siRNA转染Kyse-140细胞后能显著下调HIF-1α的表达,并导致BNIP3的表达受到明显的抑制(P0.05)。 结论: 1. BNIP3基因启动子区异常甲基化是导致其在食管鳞癌细胞中表达较弱的重要原因之一,甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR可通过抑制BNIP3基因启动子区甲基化状态,上调其表达水平。 2.DNA甲基化和组蛋白H3-K9甲基化在BNIP3基因转录抑制方面起协同作用;甲基化酶抑制剂可逆转BNIP3的高甲基化同时降低组蛋白H3-K9的甲基化水平从而上调BNIP3的表达。 3.乏氧时HIF-1α蛋白的表达升高,可通过HIF-1α依赖性途径上调BNIP3的表达,沉默HIF-1α可使BNIP3的表达降低。 4.DNA甲基化可以抑制乏氧上调BNIP3的表达,去甲基化后则可以重新激活。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R735.1

【参考文献】
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