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《天津医科大学》 2014年
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N-WASP磷酸化在肺炎衣原体感染促进VEC迁移和血管新生中的作用

王海伟  
【摘要】:目的:利用肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,C.pn)体外感染血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell,VEC)模型,观察C.pn感染对血管新生和VEC迁移能力的影响,探讨 N-WASP(Neural Wiskott-Aldrich Syndrome Protein)在 C.pn感染促进VEC迁移和血管新生中的作用。方法:1.利用HEp-2细胞体外增殖培养C.pn AR-39株,用间接免疫荧光法计算HEp-2细胞内包涵体形成单位(Inclusion-forming unit,IFU)。荧光显微镜下用小鼠抗C.pn单克隆抗体确定C.pn感染VEC成功;2.Capillary tube formation实验观察C.pn感染对血管新生的影响;3.Wound-healing实验和Transwell实验分别观察C.pn感染对VEC迁移能力的影响;4.用FITC-鬼笔环肽和兔抗人N-WASP抗体进行荧光染色,共聚焦显微镜观察C.pn感染后肌丝的分布情况及与N-WASP在VEC内的定位;5.分别于 C.pn 感染 VEC 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h和24 h后提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测 C.pn 感染 VEC 后不同时间点N-WASP mRNA表达水平;6.分别于C.p 感染 VEC 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h和24 h后提取总蛋白,Western blot检测C.pn感染VEC后不同时间点N-WASP的表达和磷酸化水平;7.利用CCK-8实验观察N-WASP特异性抑制剂Wiskostain对VEC活力的影响;8.用Wiskostain抑制N-WASP的活性后,Western blot检测各组VEC内N-WASP总蛋白及其磷酸化水平的变化;Wound-healing实验和Transwell实验分别观察各组VEC迁移能力的改变,Capillary tube formation实验观察各组VEC形成的微管腔节点数,用以评价VEC形成网状微管腔结构的能力;结果:1.C.pn感染HEp-2细胞60 h后,荧光显微镜下可见细胞内有亮苹果绿色葡萄状成簇的包涵体,表明C.pn已成功感染HEp-2细胞。据此计算C.pn的IFU为5.93×108/ml;2.5×105 IFU的C.pn悬液感染VEC 60 h后,荧光显微镜下可观察到亮苹果绿色葡萄状成簇的典型包涵体,提示C.pn感染VEC模型已成功建立;3.Capillary tube formation实验结果显示,C.pn感染24h后,VEC形成的微管腔节点数明显多于正常对照组(P0.05);4.Wound-healing实验结果显示,C.pn感染VEC 24 h后,细胞向划痕中央迁移的面积明显大于正常对照组(P0.05)。Transwell实验结果显示,C.pn感染的细胞的穿膜数明显多于正常对照组(P0.05);5.肌动蛋白聚合实验显示正常对照组的肌丝发出绿色荧光,在胞浆中呈均匀、弥漫性分布,无特异性聚合现象;N-WASP在激发光下显示为橙红色荧光,在胞膜和胞浆中分布均匀。C.pn感染后肌丝聚合呈丝状及束状,在细胞边缘处聚集增多,胞浆中的N-WASP发生转位,聚集于肌丝聚合处,明显共定位于"leading edge"处;6.RT-PCR结果显示,N-WASP mRNA的表达水平在C.pn感染VEC后的各个时间点均无明显变化,差异无统计学意义;7.Western blot 实验结果显示,C.pn感染 VEC 6 h 后 p-N-WASP(phospho Y256)表达水平开始升高;随着感染时间延长,p-N-WASP表达水平逐渐升高,10 h至12 h达到高峰状态,14 h开始下降,并持续至24 h;各组细胞中总N-WASP表达水平无明显变化;8.CCK8实验结果显示,N-WASP抑制剂Wiskostain浓度低于5 μM时,VEC的活力和正常对照组相比无明显变化,差异无统计学意义;而浓度高于10 μM时,VEC的活力较正常对照组明显减弱(P0.05),且浓度越高,细胞活力减弱越明显。9.免疫荧光实验显示,经Wiskostain(5μM)预处理后,C.pn在VEC内的感染率与C.pn感染组相比无明显差异(P0.05),表明Wiskostain在使用浓度及时间内对C.pn感染率无影响。10.使用 Wiskostain预处理 VEC 后,Westernblot 实验结果显示,Wiskostain(5μM)可明显降低p-N-WASP的表达水平;经Wiskostain预处理后,C.pn感染的VEC中p-N-WASP的表达水平较单纯C.pn感染组明显降低(P0.05),且各组VEC中总N-WASP表达无显著差异;11.Wiskostain(5 μM)预处理 VEC 后,Capillary tube formation 实验结果显示,Wiskostain预处理的C.pn感染组VEC形成的微管腔节点数明显少于单纯C.pn感染组(P0.05);Wiskostain(5μM)预处理的C.pn感染组VEC向划痕中央迁移的面积明显小于单纯C.pn感染组(P0.05);Transwell实验结果显示,Wiskostain(5 μM)预处理的C.pn感染组VEC的穿膜细胞数明显低于单纯C.pn感染组(P0.05)。结论:C.pn感染可能通过促使N-WASP(Y256)发生磷酸化促进VEC的迁移和血管新生。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R363

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