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《天津医科大学》 2011年
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microRNA-101通过靶定ATP5B调控HSV-1的复制

郑书琪  
【摘要】:目的:微小RNA(microRNA,miRNA)是一类非编码调控性单链小分子RNA,能够与特异性的靶mRNA通过碱基配对结合,对靶基因进行转录后水平调控。近年来的研究表明miRNA不仅参与正常细胞功能的调控,也在病毒与宿主之间的作用以及病毒复制等方面发挥着重要的作用。单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simpleX virus type 1,HSV-1)是一种DNA病毒,它可以引起口唇疱疹等疾病,并可以潜伏在三叉神经节形成潜伏感染。目前已经发现疱疹病毒本身可以编码病毒的miRNA,而且其表达的改变对病毒自身的复制有一定的作用,但宿主miRNA与病毒复制的关系并不是很明确,此研究的目的即探寻是否有宿主的miRNA参与了病毒复制的调控过程,这一调控过程是通过哪些基因实现的。方法:首先在HeLa细胞中,过表达和封闭miR-101后,利用病毒滴定空斑形成实验和real-time PCR分别检测病毒复制能力的变化。而后利用生物信息学方法筛选出miR-101的候选靶基因,并利用荧光报告载体实验验证miR-101对靶基因的直接调控作用。利用real-time PCR和western blot实验技术检测miR-101对靶基因mRNA和蛋白水平的表达变化。然后过表达靶基因的全长,进行挽救实验,进一步验证miR-101对靶基因的调控作用。利用RNA干扰技术敲除该靶基因后,通过病毒滴定空斑形成实验和real-time PCR实验检测靶基因对病毒复制的影响,进一步研究了该靶基因的功能。最后用real-time PCR检测HSV-1感染HeLa细胞后内源的miR-101和ATP5B的表达水平。结果:在HeLa细胞中,过表达miR-101后,病毒的复制明显受到抑制,病毒空斑的形成明显降低,病毒的DNA聚合酶基因的水平也明显降低。封闭miR-101后,病毒的复制增强,病毒的DNA聚合酶基因的水平也增加。靶基因筛选结果表明,ATP5B是miR-101的候选靶基因,其3'非翻译区包含miR-101的潜在结合位点。荧光报告载体实验证实,miR-101能够通过作用于ATP5B基因的3'非翻译区对其表达进行负性调节。在HeLa细胞中过表达miR-101,ATP5B的mRNA和蛋白水平都有明显降低;封闭miR-101后,ATP5B的mRNA和蛋白水平升高。此外,过表达不含3'UTR的ATP5B基因可以减弱miR-101对病毒增殖的抑制作用,病毒复制能力得到恢复。同时,在HeLa细胞中,敲降ATP5B后,病毒空斑的形成和病毒的DNA含量明显降低,与过表达miR-101相一致。在HSV-1感染HeLa细胞后,随着感染时间延长,miR-101的水平逐渐增加,其靶基因ATP5B的水平逐渐降低,二者呈现负相关性。结论:miRNA作为细胞基因转录后水平调节的内源性分子,参与调控病毒与宿主细胞的相互作用。本研究首次发现宿主细胞编码的miR-101具有抗病毒作用。miR-101通过降低靶基因ATP5B的表达而抑制HSV-1在HeLa细胞中增殖。在HSV-1感染HeLa细胞后,miR-101的水平逐渐增加,其靶基因ATP5B的水平逐渐降低,说明HSV-1可以通过抑制宿主的miRNA抗病毒作用来维持自身的增殖。首次确定miR-101及其靶基因对HSV-1复制的调控作用,有利于我们对病毒感染的发生和发展进行深入的了解,同时也为病毒感染的诊断和治疗提供新依据。
【关键词】:微小RNA miR-101 HSV-1 ATP5B 病毒复制
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R373
【目录】:
  • 中文摘要4-6
  • Abstract6-10
  • 符号说明10-12
  • 前言12-15
  • 研究现状、成果12-14
  • 研究目的、方法14-15
  • 一、miR-101抑制HSV-1的复制15-26
  • 1.1 材料和方法15-22
  • 1.1.1 实验材料15-16
  • 1.1.2 实验方法16-22
  • 1.2 结果22-26
  • 1.2.1 miR-101抑制了HSV-1的抑制22-26
  • 二、miR-101靶基因的筛选及验证26-41
  • 2.1 材料和方法26-35
  • 2.1.1 实验材料26-27
  • 2.1.2 实验方法27-35
  • 2.2 结果35-41
  • 2.2.1 EGFP荧光报告载体的构建35-37
  • 2.2.2 EGFP荧光报告载体实验验证ATP5B是miR-101的直接作用靶基因37-38
  • 2.2.3 检测ATP5B基因mRNA及蛋白水平在转染pcDNA3/pri-miR-101或者miR-101 ASO的HeLa细胞中的差异表达38-39
  • 2.2.4 western blot验证pCDNA3/ ATP5B的表达39
  • 2.2.5 病毒滴度空斑形成实验验证ATP5B挽救了miR-101对HSV-1复制的抑制作用39-41
  • 三、在宫颈癌细胞中敲降ATP5B抑制HSV-1的复制41-46
  • 3.1 材料和方法41-42
  • 3.1.1 实验材料41
  • 3.1.2 实验方法41-42
  • 3.2 结果42-46
  • 3.2.1 表达ATP5B-siRNA的质粒pSilencer/si- ATP5B的构建和验证42-43
  • 3.2.2 pSilencer/si- ATP5B质粒有效性的验证43-44
  • 3.2.3 MTT检测分析ATP5B对宫颈癌细胞生长活性的影响44
  • 3.2.4 病毒滴定实验分析ATP5B对单纯疱疹病毒复制能力的影响44-45
  • 3.2.5 Real-Time PCR方法检测在转染了pSilencer/si- ATP5B的HeLa细胞感染HSV-1后HSV-1 DNA pol基因的水平的改变45-46
  • 四、HSV-1感染后miR-101和ATP5B表达水平的变化46-48
  • 4.1 材料和方法46
  • 4.1.1 实验材料46
  • 4.1.2 实验方法46
  • 4.2 结果46-48
  • 4.2.1 在HSV-1感染的宫颈癌细胞中ATP5B和miR-101的表达水平呈现负相关的同步改变46-48
  • 讨论48-52
  • 小结52-54
  • 参考文献54-57
  • 发表论文和参加科研情况说明57-58
  • 综述 microRNA与病毒58-65
  • 综述参考文献62-65
  • 致谢65

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