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《天津医科大学》 2015年
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ICP4促进miR-101表达及miR-101调节HSV-1复制机制的研究

王相玲  
【摘要】:【目的】micro RNAs(mi RNAs)是一种内源性18~26 nt的单链非编码小分子RNA,在动植物体内通过靶定编码基因m RNA 3’UTR区域直接进行转录后调控从而发挥其基因表达调控功能。已有研究表明宿主细胞mi RNAs参与了病毒感染后的抗病毒免答效应,另一方面病毒感染还可引起宿主细胞内mi RNAs的表达升高或降低,宿主细胞mi RNAs与病毒感染之间存在着密切的相关性。本项目前期实验结果表明HSV-1感染He La细胞后mi R-101表达水平显著升高,并且初步确定mi R-101通过直接靶定并下调COX2(Cyclooxygenase 2)和GRSF1(G-rich RNA sequence binding factor 1)可能对HSV-1的复制产生影响。成熟的mi R-101有两个前体,为pre-mi R-101-1和pre-mi R-101-2,分别位于1号和9号染色体上,本实验室前期工作证明HSV-1感染后mi R-101的表达水平升高,以pre-mi R-101-2来源为主。因此本文拟从HSV-1诱导hsa-mi R-101-2表达升高的现象出发,深入研究HSV-1感染后宿主细胞hsa-mi R-101-2显著升高的具体机制,以及mi R-101对HSV-1复制的具体调控作用机制,深入阐明宿主细胞mi RNA与HSV-1之间的相互作用关系。【方法】本文主要从HSV-1感染后宿主细胞mi R-101显著升高的具体机制,以及mi R-101对HSV-1复制的具体调控作用机制两方面进行:1.首先通过双荧光素酶报告系统实验确定HSV-1对hsa-mi R-101-2启动子的具体作用方式,确定导致hsa-mi R-101-2启动子活性变化的HSV-1编码的作用因子。然后通过q RT-PCR实验检测该作用因子对hsa-mi R-101-2及其宿主基因表达水平的影响,进一步确定该作用因子对hsa-mi R-101-2的具体调控方式。最后通过染色质免疫共沉淀实验,凝胶电泳迁移实验确定作用因子是否作为转录因子与hsa-mi R-101-2启动子发生直接或间接的相互作用。2.首先通过病毒滴定,免疫荧光,western blot等实验进一步确定mi R-101的直接靶基因COX2和GRSF1对HSV-1复制的具体作用。然后通过q RT-PCR确定COX2对干扰素表达水平的影响;并通过western blot,RNA免疫共沉淀及凝胶电泳迁移实验确定GRSF1促进HSV-1衣壳蛋白表达的具体作用方式,最终确定COX2和GRSF1影响HSV-1复制的具体分子途径。【结果】1.双荧光素酶报告系统实验结果表明HSV-1感染后,hsa-mi R-101-2启动子活性显著增强;2.双荧光素酶报告系统实验结果表明过表达HSV-1即刻早期蛋白ICP4可以促进hsa-mi R-101-2启动子活性,q RT-PCR实验结果显示过表达ICP4可以促进hsa-mi R-101-2及其宿主基因的表达;3.染色质免疫共沉淀实验(Ch IP)及凝胶电泳迁移实验(EMSA)结果表明ICP4可以直接结合hsa-mi R-101-2启动子序列;4.病毒滴定实验,免疫荧光实验,western blot实验结果表明GRSF1可以促进HSV-1复制,而COX2可以抑制HSV-1复制;5.qRT-PCR实验结果表明COX2可以促进I/III型干扰素的表达;6.Western blot实验结果表明GRSF1可以促进HSV-1衣壳蛋白p40的表达水平;7.RNA免疫共沉淀实验及RNA凝胶电泳迁移实验结果表明GRSF1可以与p40的m RNA直接结合。【结论】通过对本课题的深入研究,具体可以得到以下3个结论:1、HSV-1通过其即刻早期蛋白ICP4诱导hsa-mi R-101-2的表达升高,ICP4可以直接结合hsa-mi R-101-2启动子序列并作为转录因子激活其转录活性。2、mi R-101的直接靶基因COX2可以通过促进I/III型干扰素的表达从而抑制HSV-1的复制。3、mi R-101的直接靶基因GRSF1可以通过结合HSV-1衣壳蛋白p40的mRNA促进其翻译表达,从而促进HSV-1的复制。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R373

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