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《天津医科大学》 2015年
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关于人脑胶质瘤中miR-144/451启动子区甲基化水平的实验研究

田媛  
【摘要】:神经胶质瘤,是成年人中最常见的原发性恶性脑肿瘤,具有极高致命性和侵袭性。目前对于胶质瘤的的治疗,效果并不显著,经过外科手术切除,术后放疗、化疗以及免疫治疗之后,肿瘤的复发率依旧居高不下,患者的平均生存期仅有14个月[1,2]。尽管,近年来对于癌症的基础生物学研究及对其他肿瘤的治疗有了诸多进展,但对于人脑胶质瘤的诊断和治疗在过去的数十年中却进展缓慢[3,4]。这其中,最主要的原因是:我们尚不清楚胶质瘤的确切发病机制。因此,寻找、研究与胶质瘤发生发展相关的基因、信号通路以及分子病理学机制,探索胶质瘤治疗的新策略和新手段便成为神经外科学的重要课题之一。Micro RNAs(mi RNAs)是一类内源性非编码RNA,长约22个核苷酸(nts),成熟mi RNAs通过与靶基因的3’UTR非转录区域完全或不完全互补的特异性结合,对基因的表达水平进行转录后调控。许多研究显示,mi RNAs在进化上具有保守性,在序列、数量、结构、表达和功能上则具有多样性,它可以调控人类细胞中约1/3的蛋白编码基因[5-7]。人类mi RNA测绘显示,许多mi RNA定位在基因组中的脆弱区域,mi RNA的异常改变可能是肿瘤细胞中存在的普遍缺陷[8]。一些mi RNA通过多样化的靶基因调控,扮演着癌基因或抑癌基因的角色;它们几乎可以参与调控人体所有细胞的恶性转化,比如细胞周期[9],DNA损伤反应[10],分化和多能性(干性)[11],上皮间质转化[12]或者转移[13]。因此,了解mi RNA的表达调控机制将为预防和治疗人类肿瘤提供全新的思路和方法。mi R-144/451簇具有共同的启动子区,且位于基因组中的脆弱区域,染色体17q11.2,与原癌基因ERBB2(17q12)相邻[14,15]。mi R-144在多种肿瘤中均有显著下调,如喉癌、恶性间皮瘤、甲状腺滤泡癌、骨肉瘤等,但关于其表达下调的原因和具体作用机制的研究较少。而mi R-451则具有抑制细胞生长、增殖、侵袭能力,并且可以促进细胞凋亡[16],在细胞中发挥着抑癌基因的作用[17]。本实验的前期研究显示,mi R-451在胶质瘤中呈现与肿瘤病理分级负性相关的低表达[17]。但究竟是什么原因导致了mi R-451在胶质瘤中表达减少?这是否是导致胶质瘤发生的一个重要原因?一系列的疑问,使我们燃起对mi RNA-144/451进行更深层次研究的极大愿望。近年来的一些研究表明,表观遗传调控对哺乳动物维护组织特异性基因表达和正常发育必不可少,表观遗传进程的紊乱将改变基因功能,使正常细胞向恶性转化。表观遗传学,即在初级DNA序列不发生改变的情况下,使基因表达发生改变,这些可遗传的稳定改变,通过细胞周期性分裂,使细胞含有相同的遗传信息。表观遗传可以通过多种方式实现对基因表达的调控,例如DNA甲基化,组蛋白修饰,染色质重塑以及RNA干扰[18]。其中,DNA甲基化具有沉默肿瘤抑制基因的能力已成为公认的事实。越来越多的证据显示,DNA的甲基化修饰可以调控近半数mi RNA的表达[19,20],而这其中,又有约一半的mi RNA在超过20种不同类型的肿瘤中存在异常的甲基化修饰[21]。为了维持机体的基本生理功能,正常的DNA甲基化是必需的,而DNA的异常甲基化修饰则会引发多种疾病,甚至是肿瘤的发生。在组织发育过程中,一旦某个基因启动子区的Cp G岛发生了异常的甲基化修饰,那么将会阻碍转录因子与启动子的结合,使基因不能被转录,或者降低了转录水平,从而导致该基因的长期沉默。因此,概括来讲就是DNA甲基化会抑制基因表达,非甲基化则使基因活化,一个沉默基因的重新激活则与去甲基化相关[22]。综上所述,本课题旨在通过对mi R-144/451启动子区Cp G岛甲基化水平的研究,从而发现mi RNA下调与DNA甲基化异常之间的关系,探索人脑胶质瘤中具有抑癌基因作用的mi RNA表达减少的根本原因,通过去甲基化处理恢复沉默基因表达,以期为胶质瘤的综合治疗提供新的方法及思路。本课题研究分为以下三个部分:第一部分中应用Real time-PCR(实时定量PCR),我们检测了3个胶质瘤细胞系,经不同浓度DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-d C溶液处理72小时后,mi R-144/451的表达水平。结果显示:5-Aza-dc可以恢复mi R-144/451在胶质瘤中的表达,说明了mi R-144/451启动子区可能存在DNA的甲基化修饰。第二部分是关于mi R-144/451启动子区甲基化水平的研究。诸多研究显示,在肿瘤的表观基因组中,存在着显著的启动子区Cp G岛的超甲基化现象[23],抑癌基因的沉默就与此有关。因此,本部分实验我们首先使用NCBI数据库查询mi R-144/451基因所在位置前的5kb碱基序列,并以此作为启动子区Cp G岛分析预测序列,应用UCSF Meth Primer和EMBOSS Cpgplot预测软件,试图寻找mi R-144/451启动子区可能存在的Cp G岛。并采用焦磷酸测序技术,对mi R-144/451启动子区Cp G岛区域的18个CG位点进行甲基化水平检测。结果显示,除位点CG12、CG18甲基化频率略低外,其他位点均存在较高的甲基化水平。因此,我们基本可以认定,在人脑胶质瘤细胞系中mi R-144/451启动子区Cp G岛存在超甲基化现象。这可能是导致抑癌基因mi R-144、mi R-451,在肿瘤细胞中表达减少的根本原因。第三部分,我们试图寻找mi R-144/451启动子区Cp G岛发生超甲基化现象的可能性原因。DNA的甲基化修饰主要依赖于DNA甲基化酶的表达水平与活性。在真核生物中存在着两种DNA甲基化酶:DNA甲基转移酶(DNMTs)和DNA去甲基化酶。在正常细胞中,DNMTs发挥着包括维持染色体稳定,沉默基因,和调节胚胎发育等多种功能。目前,已经确定的具有催化活性的DNA甲基转移酶(DNMTs)共有五个:DNMT1,DNMT2,DNMT3A,DNMT3B和DNMT3L,其中,DNMT1的表达最为丰富,它通过与基因启动子区的结合维持DNA在复制过程中的甲基化状态,因此,本实验就选择对DNMT1展开具体研究。首先,我们使用DNMT1 si RNA敲低3个胶质瘤细胞系中DNMT1的表达量,经实时定量PCR检测,mi R-144/451表达水平均有明显升高。之后,应用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术,检测DNMT1基因与mi R-144/451启动子区序列的结合能力,琼脂糖凝胶电泳观察CHIP后PCR产物,可见DNMT1 si RNA处理组较未经处理的Control组,电泳条带明显减暗,说明此组DNMT1与mi R-144/451启动子区序列的结合量减低,所以CHIP过程中能够被DNMT抗体结合的“DNMT1目的片段复合体”减少。最终导致凝胶电泳条带较暗。结果进一步证实,DNMT1通过与mi R-144/451启动子区的结合,使DNA双链上半甲基化胞嘧啶,在模板链的指导下被完全甲基化,从而抑制了mi R-144/451的表达。结论:DNA甲基转移酶抑制物5-Aza-d C可以恢复mi R-144/451在胶质瘤中的表达水平;焦磷酸测序进一步证实mi R-144/451启动子区Cp G岛存在超甲基化现象;而CHIP实验则最终分析出,DNMT1基因通过与mi R-144/451启动子区的结合使基因序列甲基化水平升高,从而抑制了胶质瘤中mi R-144/451的表达。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R739.41

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