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《天津医科大学》 2016年
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microRNA-21参与锶促细胞成骨分化及外泌体提取方法改良

王仁峰  
【摘要】:目的:锶(Sr)是人体内一种重要的微量元素,在元素周期表中与钙同族,具有相似的化学性质。作为骨的重要成分,由于具有促进骨生成和抑制骨吸收的双重作用,锶及相关生物材料在骨质疏松治疗及骨缺损填充中的应用受到高度关注,比如雷奈酸锶广泛的应用于预防和治疗骨质疏松。到目前为止,关于锶作用机制的探讨已经深入到分子层次,包括:锶与细胞膜上的钙受体或其它受体结合,激活细胞内信号通路,调节细胞分化和成熟行为,进而促进骨基质的合成等,但锶具体作用机制,仍需要进一步完善。近年来研究发现miRNA是调控成骨分化的重要转录后调节因子,对成骨细胞的分化发育具有重要调控作用,包括正性和负性双重调节作用,但miRNA这一重要转录后调节因子是否也在锶促进成骨分化机制中发挥作用尚不明确。本课题就锶促进细胞成骨分化过程中miRNA-21表达变化以及其在锶促进成骨分化过程中的作用加以探讨。外泌体(exosome)是具有脂质双层结构的膜源性小囊泡,直径多介于30-100 nm,可以由多种细胞合成。外泌体内含有不同种类的micro RNAs、蛋白质、脂质、m RNAs、t RNAs、信号分子等生物学活性物质,易与邻近细胞膜发生融合,将生物学活性物质选择性地递呈至受体细胞,从而完成信息传递,调节细胞间的信号传导,发挥生物学功能。锶促进成骨分化过程中,外泌体是否也发挥重要调控机制尚不清楚,而获得高纯度、无丢失的外泌体样本是进一步探寻该机制的研究基础。因此本课题同时就外泌体提取方法的改良比较进行探讨,为外泌体深入研究奠定基础。方法:一、采用不同浓度(0,1,3,6,9,12 mM)的氯化锶(SrCl_2)溶液对小鼠前成肌细胞C2C12进行成骨诱导72h,MTT法检测不同浓度锶对细胞增殖的影响作用,确定适宜的锶诱导浓度;实验组以1mM和3mM锶诱导C2C12细胞,对照组培养条件与实验组相同,但不加锶诱导,72h后分别提取细胞总蛋白和总RNA,以蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)检测成骨标志phospho1蛋白表达水平变化,以实时荧光定量PCR法检测phospho1以及micro RNA-21基因表达情况;同时,实验组和对照组细胞均培养7d后,进行碱性磷酸酶(ALP)染色;对C2C12细胞转染miR-21 inhibitor,6h后加入3mM锶诱导72h,检测phospho1基因以及蛋白表达情况;以PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002对细胞预处理2h,随后加入3mM锶诱导72h,检测phospho1基因及蛋白表达水平改变。二、分别用ExoQuick试剂盒及改良方法、超速离心法提取血清外泌体。利用透射电镜对外泌体进行形态学观察;样本进行2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法蛋白定量;Western blotting检测外泌体表面标志物CD63;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析样本蛋白表达差异。结果:一、MTT结果显示,低浓度锶(1,3mM)诱导细胞后,其增殖情况与对照组相比无明显差异(p0.05),而较高浓度的锶(6,9,12mM)对细胞增殖具有一定的损害作用(p0.05),因此本课题采用低浓度锶诱导C2C12细胞成骨分化;分别以1mM和3mM锶对C2C12细胞诱导72h后,phospho1基因和蛋白表达均升高(p0.05),且3mM锶对C2C12细胞的诱导成骨分化作用较1mM锶明显;同时检测小RNA miR-21发现,其表达也较对照组明显上调(p0.05);对C2C12细胞进行miR-21 inhibitor转染后,锶促进成骨作用消失,phospho1基因以及蛋白表达明显下调(p0.05);以PI3K/AKT通路抑制剂LY294002对细胞预处理后,同样抑制了锶对C2C12的诱导成骨作用,phospho1基因和蛋白表达水平下降。二、ExoQuick试剂盒及改良方法、超速离心法均可获得血清exosome,电镜下可观察到圆形或椭圆形膜性囊泡结构;传统超速离心法提取样本蛋白浓度显著低于ExoQuick试剂盒法及其改进方法(P0.05);SDS-PAGE显示三种方法提取样本蛋白表达强度及丰度存在差异;western blotting表明三种方法提取的外泌体均表达表面特异性标志物CD63,且含同浓度蛋白的情况下,ExoQuick Precipitation及改良法其CD63含量明显高于传统超速离心法。结论:一、低浓度的锶对细胞无明显毒性且具有明显的促成骨作用。结果表明,锶可通过上调miR-21促进PI3K/AKT通路活化以促进促成骨因子phsopho1的表达促进细胞成骨。二、ExoQuick试剂盒及改良方法、超速离心法均能提取血清中外泌体,ExoQuick试剂盒法及改良方法具有更高的提取外泌体效率,同时改进方法能够有效的去除提取样品中的杂蛋白。
【关键词】: 成骨分化 miR-21 phospho1 外泌体
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R336
【目录】:
  • 中文摘要4-6
  • Abstract6-10
  • 缩略语/符号说明10-11
  • 前言11-18
  • 研究现状、成果11-17
  • 研究目的、方法17-18
  • 一、锶促进成骨分化机制研究18-35
  • 1.1 对象和方法19-28
  • 1.1.1 研究对象19
  • 1.1.2 试剂与仪器19-20
  • 1.1.3 研究方法20-28
  • 1.1.4 统计学处理28
  • 1.2 结果28-31
  • 1.2.1 不同浓度锶对C2C12细胞增殖的影响28
  • 1.2.2 锶对C2C12细胞成骨分化的影响28-29
  • 1.2.3 锶促进C2C12成骨分化对miR-21的影响29-30
  • 1.2.4 锶促进C2C12成骨分化中miR-21的作用30-31
  • 1.2.5 锶促进C2C12成骨分化中PI3K/AKT通路的作用31
  • 1.3 讨论31-34
  • 1.4 小结34-35
  • 二、ExoQuick提取人血清外泌体方法改良及比较35-44
  • 2.1 对象和方法35-39
  • 2.1.1 研究对象35-36
  • 2.1.2 试剂与仪器36
  • 2.1.3 研究方法36-39
  • 2.1.4 统计学处理39
  • 2.2 结果39-42
  • 2.2.1 外泌体形态观察39-40
  • 2.2.2 不同外泌体样本蛋白浓度定量40
  • 2.2.3 SDS-PAGE电泳及凝胶图像分析40-41
  • 2.2.4 外泌体表面标志CD63分析41
  • 2.2.5 三种方法操作时间比较41-42
  • 2.3 讨论42-43
  • 2.4 小结43-44
  • 结论44-46
  • 参考文献46-57
  • 发表论文和参加科研情况说明57-58
  • 综述 microRNA与成骨分化的研究进展58-68
  • 综述参考文献63-68
  • 致谢68-69
  • 个人简历69

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