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《天津医科大学》 2016年
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共培养条件下脂肪干细胞成骨能力的改变

孙仕晨  
【摘要】:目的以体外培养的经成骨诱导后的脂肪间充质干细胞(i ASCs)为研究对象,观察i ASCs分别与骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)、胎盘间充质干细胞(PDMSCs)共同培养时,i ASCs成骨能力的变化。初步探究体内MSCs对骨祖细胞分化的调节作用。材料和方法1、ASCs提取无菌条件下吸取新鲜的人皮下吸脂术所得的脂肪组织20m L,PBS冲洗,向脂肪组织悬液中加入I型胶原酶进行震荡消化,通过贴壁法获得原代ASCs。DMEM/F-12培养液中原代培养7天,每3天换液一次,融合度达到70%-80%时传代,应用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,计数。2、cck-8检测ASCs、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs在0-7天时的增殖曲线。3、实验分组直接共培养组:取生长良好的第3代ASCs,于成骨诱导培养液中进行7天诱导(i ASCs)。经0.25%胰蛋白酶消化后,调整i ASCs密度至2×104/ml。将BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs,0.25%胰酶消化,调整各MSCs密度至1×104/ml。将100μL i ASCs分别与100μL的BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs混合加入96孔板,设实验组,即为d-BMSCs组、d-UC-MSCs组和d-PDMSCs组,每组设6复孔。对照组为3×103个i ASCs单独接种于96孔板,所设复孔数如实验组。在不同的时间间期,检测各组细胞磷酸酶活性和浓度。另设上述四组细胞,每组6孔,检测不同时间间期各组细胞矿化基质形成情况。所有细胞在24h后更换为矿化培养液。间接共培养组:生长良好的i ASCs经消化后,细胞密度如上组。将100μL i ASCs含细胞2×103个加入96孔板中,分别用BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs的条件培养液培养,设为实验组,即为ind-BMSCs组、ind-UC-MSCs组和ind-PDMSCs组,24h后各组更换为相对应的条件培养液。对照组为2×103个i ASCs培养于96孔板,为ind-i ASCs。上述四组细胞,每组6孔,检测各组细胞磷酸酶活性和浓度。另设上述四组细胞,每组6孔,检测不同时间间期各组细胞矿化基质形成情况。4、检测分析将上述96孔板置于细胞培养箱内培养,分别于第3,5,7,10,12,14天的同一时间点,每组取6孔,利用碱性磷酸酶试剂盒操作要求测定四组细胞光密度(OD)值,计数其碱性磷酸酶浓度和活性。分别于第7,10,12,14天的同一时间点,每组取6孔,利用茜素红进行染色。同时利用茜素红染料可溶于氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride,CPC)溶液重新析出的特点,定量分析矿化基质形成情况。实验所得数据利用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),以P0.05为差异具有统计学意义。结果1、对于提取的ASCs,细胞具有类似成纤维细胞的形态,具有典型的MSCs相关表面分子,同时具有向中胚层组织分化的潜能。BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs与ASCs具有相似的形态。通过绘制增殖曲线可知,增值能力UC-MSCsPDMSCsASCsBMSCs。2、ALP表达情况,不同组织来源的MSCs表现有差别。在直接共培养时,BMSCs促进i ASCs表达ALP的能力最强,其表达水平和活性均为最高,显著高于其他两种MSCs。UC-MSCs组和PDMSCs组表现相近。在间接共培养时,UC-MSCs和PDMSCs条件培养液促进i ASCs表达ALP的能力强于BMSCs。3、矿化基质形成情况,不同组织来源的MSCs同样表现不同。共培养时各实验组均高于对照组。在直接共培养时,PDMSCs组在各时间点矿化基质形成最多,UC-MSCs组矿化基质形成多于BMSCs组,但无统计学差异。在间接共培养组中,UC-MSCs条件培养液组矿化基质形成多于BMSCs和PDMSCs条件培养液组,PDMSCs条件培养液组多于BMSCs条件培养液组。结论1、采用胶原酶消化法获得的皮下脂肪来源的ASCs具有MSCs的特征。2、皮下脂肪来源的ASCs具有与BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs相似的细胞形态,生长方式和增殖特性。3、ASCs经成骨诱导7天后获得的i ASCs具有与骨祖细胞(成骨细胞前体)相似的特征,可为骨组织工程研究提供充足的细胞来源。4、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs均可促进i ASCs向成骨细胞分化。又有各自不同的特点:BMSCs可促进并维持i ASCs高表达ALP,使i ASCs处于成骨早期阶段;UC-MSCs和PDMSCs在促进ALP表达方面能力弱于BMSCs,但UC-MSCs和PDMSCs可加快i ASCs向成骨细胞分化的速度,并可促进i ASCs分泌细胞外基质。5、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs通过直接或间接接触均可调节i ASCs向成骨细胞分化,但其中直接接触调节起主要作用,直接接触时所形成的ALP和矿化基质多于间接接触时所形成的量。6、无论是否接触,共培养状态下促进i ASCs向成骨细胞分化的能力均比单独培养强。MSCs在调控骨祖细胞向成骨细胞分化过程中起重要作用。
【关键词】:脂肪干细胞 间充质干细胞 成骨共培养条件 培养液分化
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R329.2
【目录】:
  • 中文摘要4-7
  • Abstract7-11
  • 缩略语11-12
  • 前言12-14
  • 研究现状、成果12-13
  • 研究目的、方法13-14
  • 一、不同组织来源的间充质干细胞生物学特性比较14-25
  • 1.1 对象和方法14-18
  • 1.1.1 研究对象14
  • 1.1.2 仪器设备14-15
  • 1.1.3 试剂及溶液配置15-16
  • 1.1.4 流程图16
  • 1.1.5 脂肪干细胞提取与培养16-17
  • 1.1.6 脂肪干细胞鉴定17
  • 1.1.7 四种间充质干细胞生物学特性比较17-18
  • 1.1.8 数据分析18
  • 1.2 结果18-22
  • 1.2.1 脂肪干细胞的形态、表型18-19
  • 1.2.2 成骨能力19-20
  • 1.2.3 成脂能力20
  • 1.2.4 四种间充质干细胞形态学比较20-21
  • 1.2.5 四种间充质干细胞增值能力比较21-22
  • 1.3 讨论22-24
  • 1.4 小结24-25
  • 二、共培养条件下诱导脂肪干细胞成骨能力的改变25-48
  • 2.1 对象和方法25-29
  • 2.1.1 仪器设备25
  • 2.1.2 实验试剂及溶液配置25-26
  • 2.1.3 流程图26
  • 2.1.4 制备条件培养基26-27
  • 2.1.5 实验分组27-28
  • 2.1.6 碱性磷酸酶活性检测28-29
  • 2.1.7 矿化基质形成检测29
  • 2.1.8 统计分析29
  • 2.2 结果29-39
  • 2.2.1 ASCs成骨诱导29-30
  • 2.2.2 矿化培养液对三种未分化MSCs的影响30-31
  • 2.2.3 细胞比例31-32
  • 2.2.4 碱性磷酸酶比较32-36
  • 2.2.5 定量分析矿化基质形成36-39
  • 2.3 讨论39-48
  • 2.3.1 MSCs在骨组织工程中的应用39-40
  • 2.3.2 共培养在骨组织工程中的应用40-41
  • 2.3.3 诱导脂肪干细胞特征41-42
  • 2.3.4 不同共培养体系对ALP表达的影响42-43
  • 2.3.5 不同共培养体系对矿化基质形成的影响43-44
  • 2.3.6 关于实验组和对照组设置44-45
  • 2.3.7 UC-MSCs和PDMSCs的成骨能力45
  • 2.3.8 不同调节方式对iASCs成骨能力的影响45-48
  • 结论48-49
  • 参考文献49-57
  • 发表论文和参加科研情况说明57-58
  • 综述 脂肪干细胞用于组织再生的潜力58-71
  • 综述参考文献63-71
  • 致谢71-72
  • 个人简历72

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