收藏本站
《天津医科大学》 2016年
加入收藏

共培养条件下脂肪干细胞成骨能力的改变

孙仕晨  
【摘要】:目的以体外培养的经成骨诱导后的脂肪间充质干细胞(i ASCs)为研究对象,观察i ASCs分别与骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)、胎盘间充质干细胞(PDMSCs)共同培养时,i ASCs成骨能力的变化。初步探究体内MSCs对骨祖细胞分化的调节作用。材料和方法1、ASCs提取无菌条件下吸取新鲜的人皮下吸脂术所得的脂肪组织20m L,PBS冲洗,向脂肪组织悬液中加入I型胶原酶进行震荡消化,通过贴壁法获得原代ASCs。DMEM/F-12培养液中原代培养7天,每3天换液一次,融合度达到70%-80%时传代,应用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,计数。2、cck-8检测ASCs、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs在0-7天时的增殖曲线。3、实验分组直接共培养组:取生长良好的第3代ASCs,于成骨诱导培养液中进行7天诱导(i ASCs)。经0.25%胰蛋白酶消化后,调整i ASCs密度至2×104/ml。将BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs,0.25%胰酶消化,调整各MSCs密度至1×104/ml。将100μL i ASCs分别与100μL的BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs混合加入96孔板,设实验组,即为d-BMSCs组、d-UC-MSCs组和d-PDMSCs组,每组设6复孔。对照组为3×103个i ASCs单独接种于96孔板,所设复孔数如实验组。在不同的时间间期,检测各组细胞磷酸酶活性和浓度。另设上述四组细胞,每组6孔,检测不同时间间期各组细胞矿化基质形成情况。所有细胞在24h后更换为矿化培养液。间接共培养组:生长良好的i ASCs经消化后,细胞密度如上组。将100μL i ASCs含细胞2×103个加入96孔板中,分别用BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs的条件培养液培养,设为实验组,即为ind-BMSCs组、ind-UC-MSCs组和ind-PDMSCs组,24h后各组更换为相对应的条件培养液。对照组为2×103个i ASCs培养于96孔板,为ind-i ASCs。上述四组细胞,每组6孔,检测各组细胞磷酸酶活性和浓度。另设上述四组细胞,每组6孔,检测不同时间间期各组细胞矿化基质形成情况。4、检测分析将上述96孔板置于细胞培养箱内培养,分别于第3,5,7,10,12,14天的同一时间点,每组取6孔,利用碱性磷酸酶试剂盒操作要求测定四组细胞光密度(OD)值,计数其碱性磷酸酶浓度和活性。分别于第7,10,12,14天的同一时间点,每组取6孔,利用茜素红进行染色。同时利用茜素红染料可溶于氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride,CPC)溶液重新析出的特点,定量分析矿化基质形成情况。实验所得数据利用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),以P0.05为差异具有统计学意义。结果1、对于提取的ASCs,细胞具有类似成纤维细胞的形态,具有典型的MSCs相关表面分子,同时具有向中胚层组织分化的潜能。BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs与ASCs具有相似的形态。通过绘制增殖曲线可知,增值能力UC-MSCsPDMSCsASCsBMSCs。2、ALP表达情况,不同组织来源的MSCs表现有差别。在直接共培养时,BMSCs促进i ASCs表达ALP的能力最强,其表达水平和活性均为最高,显著高于其他两种MSCs。UC-MSCs组和PDMSCs组表现相近。在间接共培养时,UC-MSCs和PDMSCs条件培养液促进i ASCs表达ALP的能力强于BMSCs。3、矿化基质形成情况,不同组织来源的MSCs同样表现不同。共培养时各实验组均高于对照组。在直接共培养时,PDMSCs组在各时间点矿化基质形成最多,UC-MSCs组矿化基质形成多于BMSCs组,但无统计学差异。在间接共培养组中,UC-MSCs条件培养液组矿化基质形成多于BMSCs和PDMSCs条件培养液组,PDMSCs条件培养液组多于BMSCs条件培养液组。结论1、采用胶原酶消化法获得的皮下脂肪来源的ASCs具有MSCs的特征。2、皮下脂肪来源的ASCs具有与BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs相似的细胞形态,生长方式和增殖特性。3、ASCs经成骨诱导7天后获得的i ASCs具有与骨祖细胞(成骨细胞前体)相似的特征,可为骨组织工程研究提供充足的细胞来源。4、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs均可促进i ASCs向成骨细胞分化。又有各自不同的特点:BMSCs可促进并维持i ASCs高表达ALP,使i ASCs处于成骨早期阶段;UC-MSCs和PDMSCs在促进ALP表达方面能力弱于BMSCs,但UC-MSCs和PDMSCs可加快i ASCs向成骨细胞分化的速度,并可促进i ASCs分泌细胞外基质。5、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs通过直接或间接接触均可调节i ASCs向成骨细胞分化,但其中直接接触调节起主要作用,直接接触时所形成的ALP和矿化基质多于间接接触时所形成的量。6、无论是否接触,共培养状态下促进i ASCs向成骨细胞分化的能力均比单独培养强。MSCs在调控骨祖细胞向成骨细胞分化过程中起重要作用。
【关键词】:脂肪干细胞 间充质干细胞 成骨共培养条件 培养液分化
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R329.2
【目录】:
  • 中文摘要4-7
  • Abstract7-11
  • 缩略语11-12
  • 前言12-14
  • 研究现状、成果12-13
  • 研究目的、方法13-14
  • 一、不同组织来源的间充质干细胞生物学特性比较14-25
  • 1.1 对象和方法14-18
  • 1.1.1 研究对象14
  • 1.1.2 仪器设备14-15
  • 1.1.3 试剂及溶液配置15-16
  • 1.1.4 流程图16
  • 1.1.5 脂肪干细胞提取与培养16-17
  • 1.1.6 脂肪干细胞鉴定17
  • 1.1.7 四种间充质干细胞生物学特性比较17-18
  • 1.1.8 数据分析18
  • 1.2 结果18-22
  • 1.2.1 脂肪干细胞的形态、表型18-19
  • 1.2.2 成骨能力19-20
  • 1.2.3 成脂能力20
  • 1.2.4 四种间充质干细胞形态学比较20-21
  • 1.2.5 四种间充质干细胞增值能力比较21-22
  • 1.3 讨论22-24
  • 1.4 小结24-25
  • 二、共培养条件下诱导脂肪干细胞成骨能力的改变25-48
  • 2.1 对象和方法25-29
  • 2.1.1 仪器设备25
  • 2.1.2 实验试剂及溶液配置25-26
  • 2.1.3 流程图26
  • 2.1.4 制备条件培养基26-27
  • 2.1.5 实验分组27-28
  • 2.1.6 碱性磷酸酶活性检测28-29
  • 2.1.7 矿化基质形成检测29
  • 2.1.8 统计分析29
  • 2.2 结果29-39
  • 2.2.1 ASCs成骨诱导29-30
  • 2.2.2 矿化培养液对三种未分化MSCs的影响30-31
  • 2.2.3 细胞比例31-32
  • 2.2.4 碱性磷酸酶比较32-36
  • 2.2.5 定量分析矿化基质形成36-39
  • 2.3 讨论39-48
  • 2.3.1 MSCs在骨组织工程中的应用39-40
  • 2.3.2 共培养在骨组织工程中的应用40-41
  • 2.3.3 诱导脂肪干细胞特征41-42
  • 2.3.4 不同共培养体系对ALP表达的影响42-43
  • 2.3.5 不同共培养体系对矿化基质形成的影响43-44
  • 2.3.6 关于实验组和对照组设置44-45
  • 2.3.7 UC-MSCs和PDMSCs的成骨能力45
  • 2.3.8 不同调节方式对iASCs成骨能力的影响45-48
  • 结论48-49
  • 参考文献49-57
  • 发表论文和参加科研情况说明57-58
  • 综述 脂肪干细胞用于组织再生的潜力58-71
  • 综述参考文献63-71
  • 致谢71-72
  • 个人简历72

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 朱艳霞;刘天庆;宋克东;马学虎;崔占峰;;心肌样微环境诱导脂肪干细胞分化的研究[J];生物化学与生物物理进展;2009年05期
2 何旭;杨旭芳;张丽红;何牮;高云鹤;谭小华;李玉林;;人脂肪干细胞的形态学特征[J];生物医学工程学杂志;2011年02期
3 王婵;戴应;郭永龙;杨艳;刘庆;陈建苏;;脂肪干细胞的三维球形培养[J];中国组织工程研究;2014年06期
4 姜丽丽;刘天庆;宋克东;关水;李香琴;葛丹;;脂肪干细胞生长特性研究[J];高校化学工程学报;2014年02期
5 陈崎;彭智;;脂肪干细胞在骨、软骨组织工程中的研究进展[J];中国民族民间医药;2009年14期
6 邓骞;;脂肪干细胞探源[J];科技智囊;2013年08期
7 吕春燕;陈高莉;杨玲;陈昌金;袁慧;杨雪梅;;大鼠脂肪干细胞分离培养及细胞表型的研究[J];海南医学;2014年09期
8 龚锴;韦玉军;刘玲玲;王干;赵南明;张秀芳;公衍道;;体外培养神经细胞环境诱导脂肪干细胞向神经方向的分化[J];生物物理学报;2009年S1期
9 张珺;吕吉元;张涌;;人心包外脂肪干细胞原代培养[J];中西医结合心脑血管病杂志;2014年07期
10 周炳荣;许阳;徐妍;王影;朱丰;Felicia Permatasari;吴迪;尹志强;骆丹;;外用脂肪干细胞培养上清液对二氧化碳点阵激光焕肤术后伤口愈合的影响[J];中国中西医结合皮肤性病学杂志;2013年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王福科;刘流;赵德萍;代晓明;李逸松;何晓光;;脂肪干细胞培养中一种特异细胞的鉴定分析[A];第七届中国医师协会美容与整形医师大会论文集[C];2010年
2 张志光;索明环;;脂肪干细胞在体外长期传代后成软骨能力变化的研究[A];第七次全国颞下颌关节病学及(牙合)学研讨会暨《颞下颌关节紊乱病及口颌面疼痛的基础与临床进展》国家级继续教育学习班论文汇编[C];2008年
3 周遵善;;脂肪干细胞的基础及临床应用(英文)[A];2012全国中西医结合医学美容学术交流大会论文汇编[C];2012年
4 林云锋;敬伟;田卫东;;基于脂肪干细胞的美容与组织再生修复新策略[A];美丽人生 和谐世界——中华医学会第七次全国医学美学与美容学术年会、中华医学会医学美学与美容学分会20周年庆典暨第三届两岸四地美容医学学术论坛论文汇编[C];2010年
5 王福科;刘流;赵德萍;代晓明;李逸松;李宗芳;;大鼠脂肪干细胞培养中一种特异细胞的表型和成骨诱导分析[A];第八次全国口腔颌面—头颈肿瘤会议论文汇编[C];2009年
6 金欢;欧阳静萍;;脂肪干细胞研究近况[A];湖北省暨武汉市病理生理学会第十四届学术年会论文汇编[C];2008年
7 纪伟宁;马依彤;杨毅宁;王宝珠;刘芬;陈邦党;向阳;;脂肪干细胞的分离培养及成心肌诱导[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
8 陈明;谢良地;谢镇国;许昌声;李宏亮;;脂肪干细胞的归巢研究[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
9 徐靖宏;沈辉;郑丽君;童芸;;以玻尿酸为载体的脂肪干细胞复合物移植提高存活率的研究[A];2011年浙江省整形美容学术会议论文汇编[C];2011年
10 周遵善;;脂肪干细胞在微整形医学的应用[A];中华医学会整形外科学分会第十一次全国会议、中国人民解放军整形外科学专业委员会学术交流会、中国中西医结合学会医学美容专业委员会全国会议论文集[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前6条
1 海燕;韩美用脂肪干细胞实现骨骼再生[N];中国医药报;2007年
2 记者 邰举;韩利用脂肪干细胞克隆狗获得成功[N];科技日报;2009年
3 记者 钱铮;腹部脂肪干细胞可转为神经细胞[N];新华每日电讯;2009年
4 小直;脂肪干细胞可以产生骨骼[N];华夏时报;2001年
5 任海军;脂肪干细胞更易转变为iPS细胞[N];医药经济报;2009年
6 ;脂肪干细胞有可能再生骨髓[N];新华每日电讯;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 顾建英;脂肪干细胞与PLCL/P123静电纺纳米材料构建组织工程皮肤促创面愈合的研究[D];复旦大学;2012年
2 盛玲玲;脂肪干细胞移植促进扩张皮肤再生的实验研究[D];上海交通大学;2014年
3 赵勇;脂肪干细胞生物学特性及参与脊髓损伤修复研究[D];南方医科大学;2015年
4 申霄;脂肪干细胞微环境对衰老成纤维细胞作用及机制的研究[D];重庆医科大学;2016年
5 吴琼;基质细胞衍生因子促进脂肪干细胞向创伤区域定向迁移的研究[D];南方医科大学;2016年
6 肖波;脂肪干细胞及其来源细胞外基质构建的新型组织工程神经在周围神经修复中的应用[D];中国人民解放军医学院;2016年
7 孙敏;脂肪干细胞治疗小鼠卵巢早衰的初步研究[D];第四军医大学;2014年
8 朱艳霞;脂肪干细胞增殖特性及向心肌细胞分化的研究[D];大连理工大学;2009年
9 王淼;抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B可促进人脂肪干细胞分化[D];第二军医大学;2007年
10 王清富;聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白2基因转染脂肪干细胞的实验研究[D];南方医科大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 翁剑锐;移植脂肪干细胞对血管损伤后内膜增生的影响及机制研究[D];福建医科大学;2015年
2 刘少鹏;经肾动脉移植脂肪干细胞对大鼠急性缺血性肾损伤的治疗作用研究[D];复旦大学;2014年
3 张凯哲;Toll样受体3活化对小鼠脂肪干细胞生物学功能的影响[D];大连理工大学;2015年
4 尚志刚;慢病毒介导P63基因转染人脂肪干细胞的实验研究[D];新疆医科大学;2015年
5 依里牙尔·依里哈木;IFN-γ增强脂肪干细胞介导的免疫抑制机制[D];新疆医科大学;2015年
6 李江璇;VEGF基因修饰后人脂肪干细胞上清对成纤维细胞及内皮细胞的影响[D];暨南大学;2015年
7 祁美武;脂肪干细胞治疗放射性肌肉纤维化的实验研究[D];南华大学;2015年
8 何赤东;不同方法制备富血小板纤维蛋白对脂肪干细胞体外增殖影响的实验研究[D];南昌大学医学院;2015年
9 黄成龙;骨质疏松小鼠脂肪干细胞成骨能力的研究[D];四川医科大学;2015年
10 潘晨晨;糖尿病勃起功能障碍的临床证型与实验研究[D];成都中医药大学;2015年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026