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ADAMTS9在无菌性炎症引起的早产中的作用研究

耿倩  
【摘要】:目的本研究通过自发性早产动物模型以及细胞实验,探索在无菌性炎症环境中,ADAMTS9基因表达与胎盘组织炎症细胞浸润程度及胎膜细胞凋亡的相关性,从而阐述ADAMTS9基因表达与自发性早产的可能联系。方法动物模型构建(1)妊娠模型:8周龄C57BL/6小鼠,体重为19~21克,雌性36只随机分为3组,12只/组,雄性12只随机分为3组,4只/组;雌雄合笼,雌鼠出现阴道栓记为孕1天,3天后雌雄分离并将无阴道栓出现的雌鼠剔除。(2)无菌性炎症模型:孕10天起,3组雌鼠均腹腔注射白介素-6(IL-6),1次/2日;(3)慢病毒感染模型:ADAMTS9慢病毒敲降体系购自吉凯生物(上海,中国),包括慢病毒及对照用空载体,选用磷酸盐缓冲液(1×PBS)作为空白对照,在雌鼠孕1天、10天分别进行尾静脉注射,处理后3组小鼠分别为PBS空白对照组,空载体对照组及慢病毒敲降组。(4)早产模型:以小鼠出现阴道流血(阴道口有血渍)作为早产启动的判定标准(Romero),小鼠出现早产征象当天断颈处死,未出现则于孕19天处死;处死后取小鼠胎盘组织分为两份,一份进行QRT-PCR检测ADAMTS9 mRNA含量以验证基因敲降的效果,一份石蜡包埋行HE染色观察炎细胞浸润情况,并通过免疫组化测ADAMTS9、TNF-α、IL-6蛋白表达情况。细胞实验无菌性炎症时体内可能受累的靶细胞为胎膜细胞,因此选取人胎膜细胞系—WISH细胞系,进行ADAMTS9慢病毒敲降体系转染。处理后将细胞系分为敲降组、空白对照组以及空载体对照组,加入IL-6模拟炎症环境培养24小时后,首先利用QRT-PCR及Western blot验证慢病毒敲降ADAMTS9基因的效率并测定Caspase-3 mRNA及蛋白表达量,最后流式分析检测三组细胞的凋亡率并进行比较。结果动物实验:(1)敲降小鼠体内ADAMTS9基因后,小鼠早产率显著降低(各组早产率:空白对照组90%,空载体对照组70%,敲降组22.2%)。(2)与空白对照组及空载体对照组相比,敲降组小鼠胎盘组织中ADAMTS9 mRNA水平及蛋白表达量降低并有统计学意义(p0.05)。(3)三组小鼠胎盘组织中TNF-α、IL-6的表达均增加,说明无菌性炎症形成。与空白对照组及空载体对照组相比,敲降组小鼠胎盘组织中ADAMTS9蛋白表达显著降低。细胞实验:(1)与空白对照组及空载体对照组相比,敲降组中ADAMTS9 mRNA水平及蛋白表达量显著低于空白对照组及空载体对照组,说明慢病毒敲降体系显著抑制了ADAMTS9基因表达。(2)敲降组细胞凋亡率(21.2%)显著低于空白对照组(50.1%)及空载体对照组(52.9%),同时,并且敲降组WISH细胞中细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达显著低于空白对照组及空载体对照组。结论无菌性炎症条件下,抑制ADAMTS9基因表达可以降低妊娠小鼠早产率,其可能的作用机制为通过抑制胎膜细胞中ADAMTS9基因的表达,降低胎膜细胞凋亡率,从而抑制早产临产。因此未来有可能通过干预措施降低ADAMTS9表达从而降低早产的发生。


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