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《天津师范大学》 2014年
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青蛤(Cyclina sinensis)转录组文库测序及免疫相关序列分析

赵婷  
【摘要】:青蛤(Cyclinasinensis)是我国重要的海产经济动物,并且在国内有着悠久的养殖历史。但是,近年来由于大规模的增养殖使其栖息环境不断恶化,种质的抗病力明显下降,并且连年出现了大面积病害及死亡现象,给国民经济造成了巨大损失。因此,搞清青蛤的免疫抗病机理和免疫应答机制对于青蛤养殖业的健康可持续发展具有深远意义。研究者通过生物信息学检索,发现在GenBank中软体动物的EST数据主要集中在扇贝、牡蛎、贻贝、鲍等贝类,国内外有关青蛤功能基因的研究尚未起步。从目前GenBank已有的青蛤EST的序列看来,仅发现本实验室前期注册的20余条序列,因此,对青蛤进行转录组文库高通量测序十分必要。本研究拟通过青蛤基因序列进行生物学分析,有效地阐明青蛤基因的分子遗传背景,对于探索青蛤免疫系统各因子的功能和调控网络具有重要的理论和实践意义。本论文主要内容包括构建青蛤转录组文库及测序、序列高级分析和相关免疫基因cDNA序列生物信息学分析三个部分,旨在初步揭示青蛤免疫相关因子的基因及其免疫作用机理。本实验采用革兰氏阳性藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和革兰氏阴性鳗弧菌(Vibrio anguillarum)分别胁迫活体青蛤,抽取其血淋巴提总RNA,产物经纯化后加入裂解缓冲液将mRNA打断成短的片段,采用随机引物逆转录合成cDNA。纯化的双链cDNA再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备,单一菌刺激6h、12h的文库样本等量混合,被藤黄微球菌刺激的青蛤转录组文库主峰在552bp,被鳗弧菌刺激的青蛤转录组文库主峰在556bp。采用第二代测序技术MiSeq测序仪?pair end双端(简称PE)模式完成青蛤转录组测序,被藤黄微球菌刺激的样本(简称样本T)测序原始数据量为3.22 G,获得了 12916040条Raw reads,去除接头信息,低质量碱基,未测出的碱基,共10966322条Clean Reads;被鳗弧菌刺激的样本(简称样本M)测序原始数据量为 3.98 G,获得了 15930210 条 Raw reads,共 13389388 条 Clean Reads,测序质量高,测序错误率低,此次建库测序成功。再利用生物信息学手段对转录组序列组装拼接,拼接完成的样本T转录组序列组装拼接完成的总转录本数量为137940条,拼接完成的总基因数量为57877条,转录本长度均值(average contig)约为644.32bp。样本M总转录本数量为148238条,拼接完成的总基因数量为62152条,转录本长度均值约为618.50bp。进行Unigene编码蛋白框ORF预测分析,将序列与NR数据库、Uniprot/Swissprot数据库和Unigene ggNOG数据库做BLAST比对分析,通过Blast2GO软件完成Unigene的GO注释,根据KEGG数据库注释信息进一步对Unigene进行Pathway生物学通路的注释和预测,对Unigene进行差异表达分析。综合序列比对,基因功能注释和代谢途径的分析,共有893个基因注释到15个免疫防御相关pathway,如热休克蛋白、toll样受体等,为分析贝类免疫应答方式和免疫防御系统的的网络结构提供了必要的理论基础。论文最后章节还对本次测序获得的模式识别受体Toll 2及其通路信号分子MyD88基因的序列进行初步的生物信息学分析。
【学位授予单位】:天津师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S917.4

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