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《天津师范大学》 2014年
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青蛤(Cyclina sinensis)Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达与其重组蛋白活性分析

张皞  
【摘要】:青蛤是我国重要的海产经济动物,鉴于其具有较高的营养价值和鲜美的口味,因此青蛤的增养殖在水产行业中具有重要的地位。但是,近年来由于国内沿海地区采取高密度、高投饵和高产出的养殖方式,使青蛤的种质严重衰退、抗病力逐步下降,加之养殖区域水质污染严重,连年出现了养殖青蛤的病害和大规模死亡现象。本研究通过对青蛤免疫相关因子丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达研究,从分子水平上初步揭示其免疫作用机制及信号转导方式,为探索青蛤的免疫抗病机制、建立青蛤的健康养殖途径提供了有价值的理论基础和实验数据。文章首先介绍了青蛤的经济价值和相关研究背景,阐述了我国当前贝类养殖业中普遍存在的问题及其原因。重点说明了病原微生物—鳗弧菌对青蛤养殖的危害,并且分析了鳗弧菌的致病机理和防治方法。该部分还介绍了丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的结构及其在贝类免疫调节中的重要作用。研究者通过SMART高通量测序的方法构建了青蛤的cDNA文库,使用生物信息学分析方法,得到了青蛤丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)基因序列的全长。结果显示,青蛤SPI基因全长587bp,开放阅读框为456bp,编码151个氨基酸,其蛋白质理论分子量为16.850KD,理论等电点pI=5.74,此外,氨基酸序列1-19位为信号肽序列,48-88位和111-148位为KAZAL区域.氨基酸组成中甘氨酸(Gly)最高,占13.2%。经过与KAZAL家族其他成员进行同源性比对发现,Kazal家族的基因序列中富含半胱氨酸。由于动物体内半胱氨酸具有解毒、维持正常代谢、改善炎症和过敏反应、调整生物体自身防御机制等功能,所以SPI基因在免疫反应过程中发挥极其重要的作用。在系统发生树中显示,青蛤Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂与软体动物Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的进化距离较近,与脊椎动物进化距离较远。本研究还利用实时荧光定量RT-PCR方法,测定了 SPI基因在青蛤的血液、闭壳肌、肝脏、外套膜和鳃五个不同组织中的分布情况以及该基因经鳗弧菌刺激后在血液中的时序性表达情况。结果显示SPI基因在青蛤的以上五个组织中均有表达,但表达量差异明显,其中血液中表达含量最高,显著高于其他组织(P0.05),闭壳肌表达次之,肝脏、外套膜和鳃中含量最低,表明SPI基因主要在血液中表达。另外,在鳗弧菌侵染青蛤之后,以β-actin为内参基因,利用实时荧光定量PCR分析SPI基因在血液中的时序性表达情况。结果发现实验组在感染后3h表达量显著升高,且与对照组差异极显著(P0.01);并且在3h表达量达到最大值,约为对照组的3倍左右;在6h其表达量有所下降,但仍显著高于对照组(P0.05);在24h到48h其表达量又显著升高,且在48h又达到一表达高峰并与对照组差异极显著(P0.01);9h、12h和96h基因表达量与对照组差异不明显,说明SPI基因起着十分重要的免疫作用。研究者进一步利用基因工程的方法,建立了丝氨酸蛋白酶抑制剂的原核表达体系,将青蛤SPI基因与pET-30a表达载体相连接,转化宿主菌BL21(DE3)pLysS,经1mmol/L的IPTG诱导后,4小时后重组蛋白表达量达到最大值,经过SDS-PAGE电泳显示重组蛋白大小为23KDa左右,与预期的蛋白分子量吻合,通过亲和层析和透析法和复性等方法,获得了具有生物活性的重组蛋白。论文的最后部分研究了丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗菌作用,利用考马斯亮蓝法测定了重组蛋白粉末经PBS溶解后的浓度,使用Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白酶联反应分析试剂盒测定了重组蛋白活力浓度,揭示了重组蛋白的体外抑菌活性和体内免疫调节功能。结果显示,冻干的重组蛋白经过1mIPBS缓冲液溶解后,其浓度为2.576g/l。经过酶联反应分析的测定,其活力浓度约为435.1667 IU/L。经体外抑菌实验验证,该重组蛋白在体外有明显的抑菌活性,能够在体外直接抑制鳗弧菌的生长。将重组蛋白与鳗弧菌混合孵育后注射到青蛤体内,与单纯注射鳗弧菌相比,实验组青蛤表现出更强的微生物清除效率,可见该重组蛋白能增强青蛤免疫预防能力,说明其在青蛤体内发挥了重要的免疫抗病害作用。总之,本研究首次在青蛤体内发现了 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因,分析了该分子的结构特征以及等电点等物理性质,说明了青蛤受到鳗弧菌胁迫后该基因的表达变化情况以及其体内和体外抗菌活性,今后进一步阐明青蛤中存在的免疫识别路径及免疫防御调节机制提供了重要的实验数据。
【学位授予单位】:天津师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:Q78;S917.4

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