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《天津师范大学》 2008年
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养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)病毒性神经坏死病的调查及诊断技术研究

毛海涛  
【摘要】: 鱼类病毒性神经坏死病是近年来严重危害海淡水鱼类,引起世界范围内暴发性流行的重大传染病之一。目前,已知包括鳗鲡目、鳕形目、鲈形目、鲽形目和魨形目在内的40多种鱼类受神经坏死病毒感染,病毒可通过垂直和水平两私途径传播。仔鱼和稚鱼易受感染,病死率达90%以上,甚至100%。因此,该传染病被国际兽疫局(OIE)列为重要的鱼类病害(OIE,2000)。感染养殖牙鲆在我国属首次报道。抗生素及化学药物等均对该病作用很小,目前尚无有效的治疗方法。因此,建立快速灵敏的神经坏死病毒检测方法,及时预测预报病毒性神经坏死病的发生成为当务之急。为了尽快建立起行之有效的针对养殖牙鲆神经坏死病毒的预警机制,作者经过流行病学调查,通过筛选引物建立了适合于牙鲆病毒性神经坏死病的巢式RT-PCR检测方法。主要的结果和结论如下: 1、作者对天津地区养殖牙鲆病毒性神经坏死病的流行及危害情况进行了调查。调查发现该病主要危害牙鲆幼鱼,患病鱼体平均长度为3.50±0.48cm,平均重量为1.2±0.43g。临床症状主要表现为厌食,体色变黑,螺旋状或旋转游动,反应迟钝等。鱼体发病后数天内出现死亡,累计死亡率超过70%。脑组织超薄切片观察发现在细胞胞质中存在大量病毒粒子,细胞出现明显的空泡化病变,病毒粒子呈晶格状排列,30~35 nm,二十面体,无囊膜。 2、病原学调查结果表明:使用国际兽疫局(OIE)推荐的引物扩增NNV基因RNA2的靶序列(421bp)片段,测序后进行同源性比较及系统进化分析显示,该病毒PONNV与中国大陆报告的ECNNV和中国台湾报告的MNNV核酸同源性最高,分别达到98%和97%,与RGNNV、DLEV和DNNV的同源性也超过90%,与其他基因型的NNV同源性均低于80%,与BBV、BOV和FHV等3种α诺达病毒的核酸同源性小于10%。因此确定该病毒属于RGNNV基因型。 3、根据公共数据库GeneBank中公布的DNNV(dragon nervous necrosisvirus)、JFNNV(Japanese flounder nervous necrosis virus)和DLEV(Dicentrarchuslabrax encephalitis virus)3种海水鱼类神经坏死病毒的基因组序列,采用PrimerPremier5.0软件在衣壳蛋白高度保守区设计了3套nested-PCR引物,经过反应体系优化,建立了针对牙鲆神经坏死病毒的检测方法。3套引物(M2,L2,M5,L5;M2,L4,M5,L5;M3,L3,M3,L5)分别扩增片断长度为866bp、398bp、605bp、297bp、400bp、299bp。以其它常见海水鱼类致病病原为阴性对照,结果均没发现特异性扩增。3种检测方法的灵敏度分别达到6.7fg、67fg和67fg。
【学位授予单位】:天津师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S943

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