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胆固醇氧化酶的分离纯化及酶学性质的研究

高朋辉  
【摘要】: 为了应用胆固醇氧化酶来降解和转化食品中的胆固醇,以本实验室筛选的青霉TS406菌株为对象,从诱变育种、胆固醇氧化酶的提纯、胆固醇氧化酶的酶学性质、胆固醇氧化酶降解蛋黄胆固醇等方面进行了研究。 青霉TS406是一株产生胞外胆固醇氧化酶的菌株,在理化因子单因素诱变的基础上,通过紫外线联合硫酸二乙酯(浓度3%)和紫外线联合亚硝基胍(1.2mg/ml)两次连续复合诱变,获得了一株高产型突变株,其产酶活力从546U/L提高到了1267U/L,酶活提高了273%,并利用SPSS软件分析证明了突变菌株的产酶稳定性。 通过硫酸铵盐析,Sephadex G-75凝胶层析,DEAE-Sephadex A50离子交换层析等方法分离提纯了菌株TS406产生的胆固醇氧化酶(COD),其比活力为16.068u/mg,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该胆固醇氧化酶的分子量为30KD,并且证明了该胆固醇氧化酶为单一的肽段。 在不同条件下测定胆固醇氧化酶的活性,得到胆固醇氧化酶的最适反应温度为45℃,最适pH值为7.5,在≤40℃的条件下能够稳定保藏,在不同的反应时间对胆固醇的氧化降解反应呈现不同的规律,反应的Km值为5.0×10~(-4)。 将胆固醇氧化酶与蛋黄反应,发现作用24小时后蛋黄胆固醇的降解率达到33.8%。


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