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中华绒螯蟹精子核非浓缩的表观遗传机制

李根亮  
【摘要】:根据精子核内遗传物质存在状态的不同,可将动物的精子核分为三种类型:浓缩型、半浓缩型和非浓缩型。由于鱼精蛋白等精子核碱性蛋白(spermatozoa basic nuclear proteins, SBNP)对组蛋白的替代和对遗传物质的浓缩作用,哺乳类、鸟类等动物的精子核被浓缩成了致密的结构,这一过程还涉及到被替代组蛋白的乙酰化。纽虫、鲫鱼等半浓缩核的精子中则由于一直保持着体细胞型组蛋白而使其遗传物质与体细胞中的相一致。但中华绒螯蟹(又名河蟹)等十足目甲壳动物的精子核呈松散的纤维状,为非浓缩核,但非浓缩的机制还不清楚。 从精子发生(spermatogenesis)到顶体反应(acrosome reaction, AR)的完成,是雄性生殖细胞的整个生命历程。以河蟹精子发生和AR为模式系统,从发生过程和发展去向上来鉴定SBNP的变化和含量,有助于探明其SBNP的变化规律,可以在一定程度上解释成熟精子核DNA的存在状态和保护机制,阐明其核非浓缩的发生机制,分析十足目演化地位。另外,河蟹是我国一种重要的经济甲壳动物,研究结果还可为该经济动物的遗传育种提供基础资料,因而该研究也具有重要的经济价值。 本研究以河蟹为实验材料,在本实验室研究的基础上,通过探讨河蟹SBNP在精子发生和AR过程中的变化规律,及SBNP在这些过程中的替代与组蛋白的乙酰化修饰对精子核形态的影响,尤其对核非浓缩现象的影响,从表观遗传学的角度分析了河蟹精子核的非浓缩机制。实验结果表明: 1通过显微和超微结构观察,发现河蟹精子虽为非浓缩核,但在圆形核精细胞核中存在大量以30 nm颗粒为主的大小不一的核物质,说明核非浓缩起源于圆形核精细胞。 2通过电泳、蛋白质印迹(westerm blot, WB)和串联质谱(tandem massspectrometry MS/MS)分析及显微和超微水平的免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)、免疫荧光(immunofluorescence, IF)和免疫电镜(immunoelectron microscopy, IEM)等多种免疫定位手段,鉴定和证明了河蟹成熟精子中存在4种核心组蛋白,并在AR后的精子核中依然存在。而且,这些蛋白不仅存在于精子核中,在核外也有分布,并在精子形成过程、输精管内的进一步发育过程中或多或少地向核外转移和抛弃。因此河蟹精子核内的组蛋白含量明显少于精原细胞、精母细胞和正常体细胞。 3电泳、WB和MS分析的实验结果还表明,河蟹精子核内的组蛋白H4存在两种分子量相近的变体或修饰方式,其氨基酸序列和组成与多种动物的组蛋白H4具有高度的同源性。 4 WB和IF定位及IEM定位结果还表明,河蟹雄性生殖细胞中存在乙酰化组蛋白H3,在AR后的精子核中也有分布。其乙酰化发生于间期精原细胞、精母细胞和圆形核精细胞的核内;在AR结束阶段的核内也少量地发生了一次乙酰化。在精子发生过程中,乙酰化组蛋白H3发生了2次向核外的转移,第1次发生于早期精细胞,时间短暂但转移量大,第2次从中期精细胞开始,一直持续到精子成熟。AR过程中乙酰化组蛋白H3没有明显向核外转移。 5通过赖氨酸(lysine, Lys)和精氨酸(arginine, Arg)的特异性染色,发现在河蟹精子的整个生命历程中,Arg染色仅精细胞核和休止期前精巢中的精子核呈阳性反应,但反应弱于小鼠精子核,Lys染色也是该阶段阳性反应最强,说明精细胞中新合成了精子特异的组蛋白,且这种蛋白在休止期的精子中急剧减少。又由于核心组蛋白(包括乙酰化组蛋白H3)并不大量存在于精子核中,因此推测这是一种河蟹精子特异的组蛋白H1。 通过以上结果可以看出,河蟹精子的非浓缩核发生于精子形成过程中,是由于精子特异的组蛋白H1替代体细胞型组蛋白H1而未发生核心组蛋白替代,及组蛋白的乙酰化修饰和在核内的减少造成的。 另外,实验中还建立了河蟹精子的温差诱导法和杯状非浓缩精子核的提取方法,也对河蟹精巢的发育周期提出了新的分期依据并将之分为7个阶段。


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