收藏本站
《河北大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

艰难梭菌tcdC基因的克隆表达与抗体制备

王建霞  
【摘要】:艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)是一种厌氧生长的革兰氏阳性梭状芽孢杆菌,是人类肠道感染的主要致病菌。使用抗菌药物后可导致艰难梭菌过度生长,大量分泌毒素A(肠毒素)和毒素B(细胞毒素),产生一系列艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)症状。近年来,水环境及相关环境中艰难梭菌的检出率的不断增加,以及随着强毒株的出现,表明艰难梭菌感染在水生生物尤其是水产养殖生物中流行的可能性陡然增加。因此,深入开展艰难梭菌致病机理的研究在水生生物疾病防治方面显得尤为重要,对水产养殖及水环境健康具有积极的意义。研究表明,艰难梭菌TcdA和B毒素是机体致病的重要因子,其基因表达在致病区(PaLoc)中受多个因子调控。目前tcdC基因是否具有负调节功能尚存争论、在致病过程中的作用机制仍不明确。本研究以CD标准菌株(ATCC43255)作为研究对象,首先针对tcdC基因编码序列进行优化,将优化后的序列通过搭桥PCR方法重新合成,构建原核表达载体并转化到大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白,用纯化的TcdC蛋白免疫动物,制备了高效价的多克隆抗体,并利用所制备的抗体对艰难梭菌TcdC蛋白的表达情况进行了初步研究。研究结果如下:(1)我们根据大肠杆菌同义密码子相对频率(RFSC)表对艰难梭菌tcdC基因的密码子进行了优化,并采用搭桥PCR的方法,成功扩增出优化后的tcdC基因全长序列。(2)采用分子克隆的方法,成功构建了艰难梭菌TcdC蛋白的原核表达质粒pBVGST-S(×2)、pBVGST-L、pBVIL1-S(×2)和pBVIL1-L,经过42℃水浴诱导后,结果诱导表达的各个重组蛋白与预期的大小相符,表达的蛋白主要以包涵体形式存在。采用亲和层析和离子交换层析对目的蛋白进行纯化,获得了高纯度的融合蛋白。(3)将上述分离纯化的目的蛋白GST-S(×2)、GST-L免疫兔子制备多克隆抗体,间接ELISA法检测到抗体效价均可达到1:6.4万以上。纯化抗体的电泳结果只出现50KD、25KD,与IgG的重链、轻链分子量吻合。经Western蛋白印记实验分析表明制备的多克隆抗体能够特异性识别相应的抗原,并且其中的TcdC-L多抗可特异性识别艰难梭菌TcdC蛋白。在对CD中TcdC蛋白的表达情况进行分析时发现,TcdC蛋白存在于胞内,也存在于培养上清中,是一种膜相关蛋白,并且在菌落生长的对数期大量表达,而在稳定期则表达量降低。综上所述,本研究成功制备了艰难梭菌TcdC重组蛋白和多克隆抗体,为后续研究tcdC基因在艰难梭菌致病过程中的作用及机制奠定了基础。
【学位授予单位】:河北大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;S941.4

免费申请
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨旭;彭子元;吴永华;;艰难梭菌实验室检测方法的进展[J];中华医院感染学杂志;2016年23期
2 李正康;刘素玲;张鑫强;黄爱伟;侯铁英;;艰难梭菌感染的流行病学和疾病负担研究进展[J];中华医院感染学杂志;2016年22期
3 居阳;李燕明;;艰难梭菌感染预防与控制进展[J];中国临床医生杂志;2016年04期
4 贾天野;汤一苇;曲芬;;美国艰难梭菌感染临床诊治相关指南摘要[J];传染病信息;2015年04期
5 倪孟颖;吴长德;杨晶雪;;艰难梭菌毒素致病机理的研究进展[J];中国畜牧兽医;2014年12期
6 王暄;杨靖;赵建宏;;艰难梭菌感染治疗方法[J];分子诊断与治疗杂志;2013年06期
7 尹业师;王欣;;人艰难梭菌感染的致病机制与防治策略研究进展[J];现代生物医学进展;2013年26期
8 许方方;胡玉苗;冉珊珊;吴长德;;艰难梭菌毒素及致病基因的研究进展[J];动物医学进展;2013年07期
9 王浦;陈烨;姜泊;;艰难梭菌感染的流行病学研究进展[J];国际消化病杂志;2011年04期
10 李洪利,黄倢,周丽;亲和层析技术在现代蛋白质研究中的应用及新发展[J];海洋湖沼通报;2005年03期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 时纪元;人工合成SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表达及其多克隆抗体制备[D];第二军医大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 费稼希;粪菌移植治疗小鼠艰难梭菌感染的安全性评价[D];南方医科大学;2016年
2 牛健;重组CARDs TX蛋白的克隆、表达与纯化及多克隆抗体制备[D];天津医科大学;2014年
3 周芬芬;2012-2013年华山医院抗生素相关性腹泻患者中艰难梭菌感染的分子流行病学调查[D];复旦大学;2014年
4 蒋智华;肝癌血清标志蛋白的分离、纯化、鉴定及抗体制备的实验研究[D];广西医科大学;2007年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李潇潇;于美玲;卢圣锋;朱冰梅;景欣悦;傅淑平;;肠道菌群与肠上皮细胞在高脂高糖诱导的2型糖尿病中的作用及意义[J];中国糖尿病杂志;2017年09期
2 穆英;宋岩;那迪;;直肠癌患者肠道微生态与术后腹泻的护理[J];中国微生态学杂志;2017年04期
3 曾祥宇;陶凯雄;;粪菌移植的研究进展[J];国际消化病杂志;2017年01期
4 刘思娣;吴安华;;艰难梭菌毒力与芽孢研究进展[J];中国感染控制杂志;2016年06期
5 王安娜;张抒意;雷瑞盈;李永峰;;蛋白质-聚糖相互作用的研究进展[J];中国甜菜糖业;2016年01期
6 潘月华;李从荣;;艰难梭菌感染实验室诊断方法的研究进展[J];安徽医学;2016年02期
7 徐莉莉;陈革豫;张腾;张忠旗;韩广;李乾;赵金礼;刘建利;;新型镍离子亲和色谱介质的制备及其性能考察[J];色谱;2016年03期
8 郭沂涛;刘希望;杨亚军;许春燕;李剑勇;;含查尔酮结构(E)-4-[3-(取代苯基)丙烯酰基]苯甲酸钠的制备及抑菌活性研究[J];动物医学进展;2015年12期
9 李瑞红;;艰难梭菌感染性腹泻患者的护理及消毒隔离措施探讨[J];中医临床研究;2015年34期
10 赵建宏;时东彦;;加强病原菌耐药监测工作提高感染控制水平[J];临床荟萃;2015年09期
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 王建霞;艰难梭菌tcdC基因的克隆表达与抗体制备[D];河北大学;2017年
2 覃柳燕;广西眼镜蛇毒神经生长因子的实验研究[D];广西医科大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 Zsuzsanna Kurti;Barbara D Lovasz;Michael D Mandel;Zoltan Csima;Petra A Golovics;Bence D Csako;Anna Mohas;Lorant Gnczi;Krisztina B Gecse;Lajos S Kiss;Miklos Szathmari;Peter L Lakatos;;Burden of Clostridium difficile infection between 2010 and 2013:Trends and outcomes from an academic center in Eastern Europe[J];World Journal of Gastroenterology;2015年21期
2 李先平;李文革;王晶;卢金星;;中美艰难梭菌A-B+株毒力编码区域转录及B毒素表达的研究[J];中国感染控制杂志;2014年02期
3 程慧;李芳;;IL-8与结直肠癌[J];大连医科大学学报;2014年01期
4 尹业师;王欣;;人艰难梭菌感染的致病机制与防治策略研究进展[J];现代生物医学进展;2013年26期
5 张建华;宋铁牛;李斌;苟云久;王志强;;艰难梭菌A毒素对食管癌干细胞损伤的研究[J];中国现代医学杂志;2013年25期
6 薛超辉;张兰威;王淑梅;李洪波;;益生菌预防与治疗艰难梭菌腹泻的研究进展[J];食品工业科技;2013年22期
7 许方方;胡玉苗;冉珊珊;吴长德;;艰难梭菌毒素及致病基因的研究进展[J];动物医学进展;2013年07期
8 杨雪妹;吴允孚;;艰难梭菌感染的流行病学和诊治进展[J];中国感染与化疗杂志;2013年04期
9 杨雪妹;吴允孚;;艰难梭菌的生物学特性与实验室诊断[J];中国感染与化疗杂志;2013年03期
10 曹波;李先平;程颖;;艰难梭菌引起抗感染免疫的主要致病因子及其基因功能的研究进展[J];免疫学杂志;2013年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 周建国;全琦;傅思武;;艰难梭菌的研究进展[J];中国微生态学杂志;2012年02期
2 张春莹;康梅;何超;陈知行;马莹;谢轶;;艰难梭菌腹泻及实验室诊断[J];寄生虫病与感染性疾病;2012年02期
3 杨雪妹;吴允孚;;艰难梭菌的生物学特性与实验室诊断[J];中国感染与化疗杂志;2013年03期
4 苏文金;;艰难梭菌及其致病力[J];中国微生态学杂志;1992年04期
5 张元和;;体内外对艰难梭菌的抗定居特征[J];国外医学(微生物学分册);1993年06期
6 Aspinall ST ,秦思栋;艰难梭菌的快速鉴定试验[J];微生物学免疫学进展;1993年03期
7 傅思武;毛敏燕;苏露;米友军;;艰难梭菌B毒素的纯化及其生物学特性[J];中国生物制品学杂志;2011年10期
8 严其容;李文革;许文荣;程颖;;25株艰难梭菌多位点序列分型[J];临床检验杂志;2012年03期
9 李卫敏;答嵘;曹晖;张敬华;韩蓓;;微生态制剂在控制艰难梭菌相关腹泻中的应用现状与前景[J];中国微生态学杂志;2013年05期
10 傅思武,周殿元;艰难梭菌A毒素的纯化[J];中国生化药物杂志;2004年02期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 刘文恩;;艰难梭菌相关性腹泻实验室诊断[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
2 常晓;;艰难梭菌(难辨梭菌)相关性腹泻流行性分析[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
3 张春莹;康梅;何超;陈知行;马莹;谢轶;;艰难梭菌相关腹泻的临床分析与实验室诊断[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 徐建国;当心致命性艰难梭菌夺命[N];健康报;2005年
2 ;抗击艰难梭菌是艰难之战[N];健康报;2011年
3 中国疾控中心传染病所医院感染控制室 程颖 传染病预防控制国家重点实验室 卢金星;警惕艰难梭菌引发的医院感染[N];中国医药报;2011年
4 常丽君;人体拥有抵抗艰难梭菌的天然机制[N];科技日报;2011年
5 医文;赛诺菲—巴斯德艰难梭菌疫苗进入临床试验新阶段[N];中国医药报;2009年
6 本报记者 刘远芬;艰难梭菌相关性肠炎有望被遏制[N];医药经济报;2007年
7 马艳红;艰难梭菌相关性腹泻给临床带来新挑战[N];中国医药报;2007年
8 记者  毛文波;“艰难梭菌”肆虐法国北部[N];科技日报;2006年
9 马艳红;规范诊治艰难梭菌相关性腹泻[N];中国医药报;2007年
10 阿胜 编译;住院病人发生艰难梭菌腹泻PPI是重要危险因素[N];医药经济报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 陈丽丹;不同来源的艰难梭菌其毒素、MLST分型及药敏情况的分析[D];南方医科大学;2016年
2 王浦;华南地区艰难梭菌流行病学研究与新型分子生物学检测技术评估[D];南方医科大学;2014年
3 李春辉;艰难梭菌多位点序列分型及感染危险因素的流行病学[D];中南大学;2014年
4 杨晓强;艰难梭菌基因重组乳链菌口服活菌疫苗的应用基础研究[D];第一军医大学;2006年
5 傅思武;艰难梭菌A毒素ELISA试剂盒的研制及微生态制剂对艰难梭菌感染的防治研究[D];第一军医大学;2004年
6 王海鹰;艰难梭菌葡萄糖基转移酶基因突变毒素及其在疫苗应用中的研究[D];华南理工大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 田甜甜;健康人群携带艰难梭菌的分子流行病学及其耐药性研究[D];河北医科大学;2015年
2 徐少华;小檗碱单用或联合万古霉素对艰难梭菌的体外及体内抗菌活性研究[D];复旦大学;2013年
3 林敏怡;环介导恒温扩增法快速检测艰难梭菌毒素基因[D];南方医科大学;2015年
4 田丽娜;艰难梭菌TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法研究[D];中国疾病预防控制中心;2013年
5 曹波;我国部分地区艰难梭菌A/B毒素基因多态性研究[D];中国疾病预防控制中心;2013年
6 张美兰;多重荧光定量PCR检测艰难梭菌感染的方法探索[D];重庆医科大学;2016年
7 李志荣;艰难梭菌二元基因分型方法建立及方法学对比研究[D];河北医科大学;2016年
8 徐凯悦;2010-2015年临床分离艰难梭菌产毒株的分子流行病学、耐药状况以及对利福霉素耐药机制研究[D];河北医科大学;2016年
9 李茹鑫;ST37型艰难梭菌耐药特征及其应用MALDI-TOF MS快速鉴定方法的建立[D];河北医科大学;2017年
10 王建霞;艰难梭菌tcdC基因的克隆表达与抗体制备[D];河北大学;2017年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026