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《河北大学》 2017年
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基于DNAzyme的多功能纳米载体的构建及其在乳腺癌基因治疗中的应用

靳祎  
【摘要】:乳腺癌是危害女性健康的主要恶性肿瘤,它的发生、发展涉及多种基因的改变。随着分子生物学技术的迅猛发展,越来越多的乳腺癌相关基因被确认,基因治疗成为乳腺癌治疗的一个新途径和研究热点,近年来已被证明有着极大的临床应用前景。在众多基因疗法策略中,DNAzyme具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化目标mRNA特定部位的切割,同时因其具有廉价低毒、易于合成和修饰、高稳定性和特异性的优势倍受青睐。借助DNAzyme,我们可以靶向沉默肿瘤细胞中有助于癌症恶化的基因,从而特异性的抑制肿瘤的生长,实现个体化治疗。然而,如何实现DNAzyme安全有效的体内递送及如何高效实现其靶向基因沉默功能是DNAzyme作为基因治疗药物走向临床应用的瓶颈。为此,本论文设计了基于DNAzyme的可降解的、多功能的纳米花及DNAzyme“纳米海绵”,用于乳腺癌靶向基因治疗。具体工作主要分为以下两部分:1.针对乳腺癌的基因治疗中,使用单一基因沉默试剂疗效局限性及以往基因载体不易降解的问题,我们构建了一种可降解的、多功能的DNAzyme纳米花样结构(DNFs)。在构建的体系中,利用滚环复制放大技术引入了核酸适配体aptamer、沉默EGR-1和survivin双重基因的DNAzyme,通过靶向、双重基因沉默功能用于乳腺癌的基因治疗,同时合成DNA纳米花还可以作为药物载体,实现药物靶向运输。体外和体内的研究结果表明,DNFs具有高效的基因沉默功能,降低靶基因在mRNA和蛋白的表达水平,从而诱导细胞凋亡,而且相对于单一基因沉默功能的DNFs具有更强的抗肿瘤活性。2.针对乳腺癌光热治疗中产生的热抗性而降低治疗效果的问题,我们构建了一个基于DNAzyme沉默热休克蛋白(HSP)基因的“纳米海绵”,通过阳离子聚合物和一条具有多拷贝的单链DNAzyme简单装配而成,借助静电作用力吸附小分子光热试剂ICG。该体系在近红外光照射下,释放的DNAzyme通过基因沉默的方式,下调癌细胞的耐热基因HSP70,有效增强了肿瘤细胞对光热的敏感性,同时利用体系的光热效应使得肿瘤区域迅速升温,从而有效杀死肿瘤。体外研究表明,这个nanosponge-ICG治疗体系在光热治疗中可以下调HSP70蛋白的表达到正常水平,抑制热休克反应,提高治疗效率。同时,利用荧光、光声成像示踪到nanosponge-ICG可以有效富集在肿瘤组织中。体内抗肿瘤实验结果表明,nanosponge-ICG可以高效的抑制肿瘤生长,而且无明显的脏器及血液毒性,因此可以作为一种新型生物相容好的治疗试剂用于乳腺癌的光热、基因联合治疗。总之,本论文是以DNAzyme为基因沉默试剂,针对乳腺癌基因治疗,DNAzyme在递送过程中如何克服生理屏障及进入体内、细胞后,如何保证其安全、高效发挥催化活性,构建了两种纳米载体,并在体内外的抗肿瘤实验中显示高效的抗肿瘤活性。本文的研究结果为今后DNAzyme作为基因药物走向临床应用提供了基础性研究数据,无疑具有重要的科学意义。
【关键词】:乳腺癌 DNAzyme 基因沉默 可降解 热抗性
【学位授予单位】:河北大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R737.9;TB383.1
【目录】:
  • 摘要5-7
  • Abstract7-9
  • 缩略语说明(按首字母顺序)9-13
  • 第1章 绪论13-35
  • 1.1 乳腺癌治疗现状13
  • 1.2 乳腺癌的基因治疗13-33
  • 1.2.1 乳腺癌基因疗法的分类13-23
  • 1.2.2 乳腺癌基因治疗常用的基因干预技术23-32
  • 1.2.3 乳腺癌基因治疗存在的问题32-33
  • 1.3 本论文的课题设计及主要研究内容33-35
  • 1.3.1 立项依据33-34
  • 1.3.2 本文研究的主要内容34-35
  • 第2章 可降解的、多功能DNAzyme纳米花的构建及其在乳腺癌基因治疗中的应用35-70
  • 2.1 引言35-36
  • 2.2 实验部分36-49
  • 2.2.1 细胞株与动物36-37
  • 2.2.2 仪器与试剂37-40
  • 2.2.3 DNFs的制备40
  • 2.2.4 DNFs理化性质表征40-42
  • 2.2.5 对乳腺癌细胞的作用42-45
  • 2.2.6 对裸鼠移植瘤生长抑制作用的研究45-49
  • 2.2.7 统计学处理49
  • 2.3 实验结果与讨论49-68
  • 2.3.1 DNFs的合成及表征49-52
  • 2.3.2 DNFs的稳定性和降解性52-54
  • 2.3.3 DNFs的催化性能54-55
  • 2.3.4 DNFs的载药性能55-57
  • 2.3.5 DNFs的靶向识别功能及内吞机制57-60
  • 2.3.6 在细胞水平对DNFs的基因沉默性能检测60-61
  • 2.3.7 DNFs对乳腺癌细胞增殖的抑制及诱导细胞凋亡的影响61-65
  • 2.3.8 DNFs对裸鼠移植瘤生长抑制作用的影响65-68
  • 2.4 本章小结68-70
  • 第3章 基于DNAzyme的“纳米海绵”的构建及在克服乳腺癌光热治疗热抗性中的应用70-102
  • 3.1 引言70-72
  • 3.2 实验部分72-79
  • 3.2.1 细胞株与动物72
  • 3.2.2 仪器与试剂72-74
  • 3.2.3 nanosponge-ICG的制备74-76
  • 3.2.4 nanosponge-ICG理化性质表征76-77
  • 3.2.5 热休克反应检测77
  • 3.2.6 对乳腺癌细胞的光热增敏作用的研究77-78
  • 3.2.7 nanosponge-ICG对移植瘤裸鼠的光热增敏作用78-79
  • 3.2.8 统计学处理79
  • 3.3 实验结果与讨论79-101
  • 3.3.1 nanosponge-ICG的合成及表征79-86
  • 3.3.2 热休克反应86-87
  • 3.3.3 nanosponge-ICG对MCF-7 细胞的光热增敏作用87-91
  • 3.3.4 nanosponge-ICG对移植瘤裸鼠的光热增敏作用91-101
  • 3.4 本章小结101-102
  • 结语102-103
  • 参考文献103-112
  • 致谢112-113
  • 攻读学位期间取得的科研成果113

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