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草麻黄体外培养及抗旱基因转化

崔东亚  
【摘要】:草麻黄作为传统中药市场需求量很大,但是干旱和盐碱严重制约草麻黄的产量,抗旱耐盐碱草麻黄的研制将对中草药草麻黄开发有现实经济意义。本研究以草麻黄为试材研究了草麻黄不同外植体、激素配比、基本培养基、pH值、子叶放置方式等对草麻黄愈伤组织诱导和植株再生的影响,利用基因枪转化将抗旱基因lea3导入麻黄愈伤组织细胞中,愈伤组织植株再生获得含抗旱基因lea3再生植株。 草麻黄愈伤组织诱导研究表明,不同外植体来源对愈伤组织诱导结果不同,子叶和胚轴外植体来源对愈伤组织诱导效果明显好于胚根来源对愈伤组织诱导效果,三种外植体来源的愈伤组织诱导率分别为65.2%、57.4%和1.2%。培养基组成和激素配比也直接影响愈伤组织生成,最终确定草麻黄愈伤组织最佳诱导条件为MS+2,4-D1.5mg/L+6-BA1.0mg/L+蔗糖30mg/L。在草麻黄愈伤组织悬浮培养中发现,MS+2,4-D2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+CH250mg/L+YE250mg/L+30g/L蔗糖+5g/L葡萄糖,为细胞悬浮最佳培养基。通过对草麻黄愈伤组织生长规律研究发现,愈伤组织最佳培养基成分为N6+2,4-D2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+30g/L蔗糖,生长旺盛期是在继代培养后第24-28d,对愈伤组织生长过程中的POD和PPO两种酶活测定也说明了这一点。草麻黄愈伤组织再生培养中研究了培养基组成、激素、pH值等因素对愈伤组织再生植株的影响,得到适于草麻黄愈伤组织分化的培养基MS+NAA0.2mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖30mg/L,pH5.8-6.0,麻黄愈伤组织再生率为15%。 在建立麻黄愈伤组织诱导和再生体系基础上,利用基因枪法将带有抗旱耐盐碱基因lea3的PBY520质粒导入麻黄组织细胞中,经过除草剂Bialaphos 3次筛选得到具除草剂Bialaphos抗性愈伤组织,Bialsphos抗性愈伤组织得率为12.83%;将Bialsphos抗性愈伤组织置于分化培养基上培养4周,得到除草剂抗性再生植株7株,再生率为12.5%。通过对试剂盒、SDS和CTAB三种植物DNA提取方法比较,发现CTAB法提取麻黄总DNA最有效、快捷。经PCR检测除草剂抗性草麻黄再生植株,最终从7株除草剂抗性植株中得到5株阳性lea3基因转化植株,阳性植株检出率为71.4%,最终转化植株的得率为1.1%。


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