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《河北大学》 2006年
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蚯蚓(Eisenia fetida)抗菌肽40kDa Fetidin基因的克隆与表达

柳伟强  
【摘要】: 抗菌肽是指在多种生物天然免疫系统中,由基因编码、核糖体合成的具有抗菌活性的一类多肽。蚯蚓经过几亿年的进化逐渐形成了抵御外来微生物侵袭的机制,可以产生一些抗菌成分。从电击蚯蚓(Eisenia fetida)渗出的体腔液中分离到两种有抑菌活性的蛋白,命名为Fetidins,其表观分子量分别为40kDa和45kDa。Fetidins是由蚯蚓的黄体细胞分泌的,是蚯蚓体腔液的主要组分,占其总蛋白量的20%左右,它能够抑制病原菌嗜水性单胞菌(Aeromonas hydrophila)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、金黄色葡萄球菌(Staphytococcus aureus)和柑橘类支原体柠檬螺旋体(Spiroplasma citri)的生长。Fetidins的抗菌特性为其开发为外用抗菌医药和农用抗菌药提供了依据,本研究的目的是通过基因克隆技术,获得重组40kDa Fetidin。 本实验使用TRIzol试剂提取蚯蚓总RNA,经RT-PCR获得了编码40kDa Fetidin基因完整读码框的cDNA序列。选用pKW32、pMXB10作为载体,经过定向克隆与40kDa Fetidin基因分别成功构建融合pKW32-fetidin和非融合表达载体pMXB10-fetidin,利用CaCl_2法分别转化大肠杆菌DH5α和ER2566,通过抗性筛选、双酶切、PCR鉴定,得到了含有目的基因的阳性克隆。间接检测pKW32-fetidin在E.coli DH5α中的遗传稳定性显示,表达产物对宿主有毒害作用使得质粒在宿主中遗传不稳定,低温诱导表达和增加抗生素的选择压力都有助于提高质粒在宿主中的遗传稳定性,从而提高了其表达量。SDS-PAGE和金属亲和层析纯化证明,所得的阳性克隆通过诱导,均可得到目的蛋白的表达,并且在细菌胞质内以包含体形式存在。对表达产物进行复性,结果显示无论是融合表达的VHb-Fetidin还是非融合表达的Fetidin都无法用稀释法和尿素浓度梯度透析法成功复性,只有VHb-Fetidin可以通过金属亲和层析柱成功复性。活性测定显示,重组蛋白具有一定抗菌活性,但是还需要进一步对复性方法和各种可能影响活性的因素进行摸索。
【学位授予单位】:河北大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q78

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