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《河北大学》 2010年
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酒石酸诺卡氏菌发酵产顺式环氧琥珀酸水解酶的研究

彭亮亮  
【摘要】: 目前,工业上生产L(+)-酒石酸主要采用生物合成法,即利用顺式环氧琥珀酸水解酶(ESH)作为催化剂,将底物顺式环氧琥珀酸(ES)转化生成L(+)-酒石酸。本论文从应用的角度出发,对酒石酸诺卡氏菌高产ESH菌株进行了筛选,并研究了其发酵特性,优化了发酵培养基,建立了一种快速测定ESH酶活的新方法。本论文主要进行了以下几方面研究: 1.高产菌株的筛选: 将工厂提供的菌株通过分离纯化获得50个菌株,经生长和产酶能力测定从中筛选出15支活性较高的菌株,再通过多次传代复筛后,得到了两株活性较高且产酶稳定的菌株,其总酶活较出发菌株提高了21-30%。 2.酒石酸诺卡氏菌发酵特性研究 研究考察了酒石酸诺卡氏菌发酵过程中碳源、氮源、pH等主要控制参数和细胞量、总酶活、比酶活的变化特性。结果表明,当发酵培养基中同时含有葡萄糖和丙二醇时,葡萄糖作为优先碳源首先被利用;随着葡萄糖代谢副产物有机酸的积累导致pH下降,当葡萄糖耗尽后,发酵液pH开始上升;菌体的诱导产酶期位于对数生长期,此时发酵液中有L(+)-酒石酸生成,但菌体并不利用产生的酒石酸。在这一条件下,整个发酵周期约为40 h,菌体浓度可达30 g/L,酶活力可达515 U/g。 3.快速测定ESH酶活方法的建立 以酒石酸诺卡氏菌细胞超声破碎液为材料,通过对转化生成L(+)-酒石酸过程中的底物浓度,酶浓度,转化时间的正交实验研究,建立了一种快速检测细胞ESH酶活的新方法。即1 g湿细胞,30 mL 0.2 mol/L的ES,37℃保温转化10 min,通过HPLC测定酒石酸含量来计算酶活。此方法具有快速、准确、细胞用量少的特点。 4.酒石酸诺卡氏菌发酵培养基的优化 通过单因子实验,考察了碳源种类与浓度,ES浓度与添加时间,产物酒石酸对发酵产ESH的影响。研究表明,菌体生长的最佳碳源为葡萄糖,产ESH的最佳碳源为蔗糖,两者的最适浓度均为5 g/L;当ES浓度小于40 g/L时,ES对菌体生长没有抑制作用,ES的最适浓度为20 g/L;在菌体生长到对数期添加ES可以提高菌体的产酶量。实验还发现,酒石酸可延缓菌体利用ES的速率,从而延长了ESH的诱导产生期。综合以上条件,将培养基优化后,菌体总酶活较优化前提高了22.8%。
【学位授予单位】:河北大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TQ925

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