用于细胞内钙离子检测的微流控芯片关键技术与实验研究

【摘要】：微流控芯片可以完成化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等功能。由于它有样品消耗量小，处理时间短和成本低的优点，在化学、生物学和医学等方面得到了广泛的应用，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能。钙离子作为一种非常重要的细胞内第二信使，广泛参与了信号的传导过程，在肌肉收缩、神经传递、酶和激素分泌等多种生物活动中发挥重要作用。近年来，大量研究表明，TRP通道也是Ca~(2+)摄入的途径，它具有介导感觉信号的传递、调节细胞钙平衡和影响发育等功能。TRPV4属于非选择性阳离子通道，对钙离子有通透性，参与维持机体内环境的稳定，对机体许多生理功能的正常完成具有重要意义。通过对它在调节胞内Ca~(2+)平衡，传递细胞外信号方面的机制做详细的研究，为临床上诸如病理性疼痛、触压觉障碍、体液平衡失调等功能障碍的研究提供了新的思路。 本论文来源于天津市自然科学基金资助项目“用于活体细胞内钙离子测量的微流控芯片及检测系统研究”（批号为：08JCYBJC03100）的资助。 论文的主要内容包括： 1.阐述了流体动力学的基础理论，讨论了连续性方程、欧拉方程和N-S方程等控制方程。研究了CFD求解复杂流体流动问题的思路和基本工作过程。介绍了微流体力学理论，并对微流体的连续方程、动量方程和微通道内物质扩散控制方程进行了研究。建立了微流控芯片混合模型，介绍了微通道流场的数值模拟方法。 2.对微流控芯片的混合特性进行了数值模拟。首先设定了以流体扩散为主的微流控芯片的模型结构，并研究了在该模型下的控制方程和混合原理。通过采用不同的流体参数，对微流控芯片内通道流场进行了数值计算，模拟了微通道中混合溶液的质量分数分布，详细研究了入口角度、雷诺数、扩散系数等几种主要流体参数对混合的影响。通过对不同参数下混合性能的比较，对导致流场混合性能的差异进行了分析和总结。 3.介绍了激光诱导荧光法检测钙离子浓度的原理，在此基础上，将微流控芯片应用到检测方案中，研究了微流控细胞荧光检测系统。基于对微流控芯片混合性能的分析，以PDMS材料作为芯片的基片，设计并制作了钙离子浓度检测的微流控芯片。 4.利用微流控细胞荧光检测系统进行钙离子浓度检测，设计了多组实验，结合荧光比值计算方法，进行了细胞内受激发钙离子荧光强度比值的测量。通过动态获取不同波长的荧光比值，研究了TRPV4通道对胞内钙离子浓度的影响。 本文的主要创新点包括： 1.对以流体扩散为主的微流控芯片进行了数值模拟，研究了几种主要流体参数对混合的影响，为设计钙离子检测的微流控芯片提供了基础，对于微流控芯片中样本的快速反应和检测具有重要的意义和参考价值 2.进行了多组检测实验，利用微流控细胞荧光检测系统，对细胞内钙离子浓度变化和分布进行了检测。得到了在温度升高、低渗透压、剪切力、佛波醇酯衍生物等多种理化刺激下，胞内钙离子浓度升高的重要结论。 3.进行了多组实验，通过分析荧光比值变化的测量结果，研究了TRPV4通道的机械敏感性和温度敏感性，各种比较实验的结果表明[Ca~(2+)])i升高的特征与TRPV4通道活化的特征相符。 4.详细研究了TRPV4通道活化对钙离子转运机制的影响。通过对多种试剂的实验结果进行对比分析发现，TRPV4通道受多种理化刺激所激活，引发胞外Ca~(2+)内流，是最终导致胞内钙离子浓度显著升高的原因。