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丁苯酞对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及相关因子表达的影响

赵素晨  
【摘要】:目的研究丁苯酞对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用;探讨丁苯酞对细胞凋亡相关因子p53、Bax、Bcl-2表达的影响。方法用DMEM/F12=1:1培养基(含10%的胎牛血清)体外培养SH-SY5Y细胞,加入1mmol/L MPP+处理,继续培养SH-SY5Y细胞24小时,进行后续实验检测。实验分为六组:空白对照组、MPP+模型组、1μmol/L丁苯酞+MPP+处理组、10μmol/L丁苯酞+MPP+处理组、20μmol/L丁苯酞+MPP+处理组、p53抑制剂+MPP+处理组。1采用MTT比色法对各组SH-SY5Y细胞的存活率进行检测;2选用倒置显微镜对各组SH-SY5Y细胞的形态进行观测;3选用Annexin-V/PI流式细胞术对各组SH-SY5Y细胞的凋亡率进行检测;4采用罗丹明123染色对各组SHSY5Y细胞的线粒体膜电位进行观测;5采用Western blot方法对各组SH-SY5Y细胞中p53、Bax、Bcl-2蛋白表达量进行检测;6采用RT-q PCR技术对各组SHSY5Y细胞中p53、Bax、Bcl-2基因m RNA的相对表达量进行检测。结果1 MTT检测细胞存活率的结果显示,与空白对照组比较,MPP+诱导后细胞存活率显著降低(P0.05);给予丁苯酞预处理后,细胞存活率较模型组比较逐渐升高(P0.05),且具有一定浓度依赖性;加入p53抑制剂干预后,细胞的存活率与模型组比较也出现明显的升高(P0.05)。2倒置显微镜观察各组细胞形态学变化结果显示,空白对照组的细胞大体为梭状或三角状,细胞间树突状结构较长较多且细胞分布呈网状结构;MPP+诱导模型组细胞大部分皱缩变圆,突起结构减少且突起长度变短,贴壁细胞数目减少;丁苯酞预处理组,随着丁苯酞浓度的增高,细胞形态逐渐好转,且高剂量组细胞形态特征接近空白对照组;加入p53抑制剂干预后的细胞形态较模型组比较也明显改善。3 Annexin-V/PI流式细胞分析术检测细胞凋亡率的结果显示,MPP+作用SH-SY5Y细胞后,与空白对照组比较,细胞凋亡率明显上升(P0.05),表明细胞发生了凋亡;给予丁苯酞预处理后,细胞凋亡率较模型组比较显著降低(P0.05),随着丁苯酞浓度增加,细胞凋亡率逐渐下降;当细胞中加入p53抑制剂干预后,与模型组比较,其细胞凋亡率也出现明显下降趋势(P0.05)。4罗丹明123染色检测各组细胞线粒体膜电位变化的结果显示,MPP+诱导可使细胞荧光强度增强,表明凋亡发生,线粒体膜电位显著下降(P0.05);给予不同浓度丁苯酞预处理后,可以明显改善由MPP+诱导引起的线粒体膜电位的降低,使荧光强度逐渐降低,细胞线粒体膜电位逐渐升高(P 0.05);加入p53抑制剂干预后,细胞荧光强度与模型组比较也显著下降,线粒体膜电位明显升高(P0.05)。5 Western blot检测p53、Bax和Bcl-2蛋白的表达结果显示,细胞经MPP+诱导后p53和Bax蛋白的表达量明显增高,Bcl-2蛋白的表达量明显下降(P0.05);给予不同浓度丁苯酞预处理后,与模型组比较,p53和Bax蛋白的表达量又逐渐降低,Bcl-2蛋白的表达量逐渐增加(P0.05);同样给予p53抑制剂干预后,各蛋白表达量与给予丁苯酞处理结果相类似,使p53和Bax蛋白的表达量降低,Bcl-2蛋白的表达量增加(P0.05)。6 RT-q PCR检测p53、Bax和Bcl-2基因m RNA相对表达量的结果显示,细胞经MPP+诱导后p53和Bax基因m RNA的相对表达量明显增高,Bcl-2基因m RNA的相对表达量明显下降(P0.05);给予不同浓度丁苯酞预处理后,与模型组比较,p53和Bax基因m RNA的相对表达量逐渐下降,Bcl-2基因m RNA的相对表达量逐渐升高(P0.05);给予p53抑制剂干预后,p53基因及其相关凋亡基因Bax、Bcl-2的m RNA表达变化与给予丁苯酞干预后的结果也呈现出了较为相似的结果,下调了p53和Bax基因m RNA的表达水平,上调了Bcl-2基因m RNA的表达水平(P0.05)。结论1丁苯酞对MPP+诱导SH-SY5Y细胞出现的凋亡具有一定抑制作用,且这种抑制作用与药物浓度有关。2丁苯酞抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的机制可能是通过调节p53及其下游因子Bax/Bcl-2的表达,从而影响细胞凋亡的发生,发挥一定的保护作用。


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