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《华北理工大学》 2017年
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CCAT2基因相关转录因子在KM12SM细胞中的筛选与鉴定

蔡文臣  
【摘要】:目的通过检测CCAT2在KM12SM中G/T转录活性差异,分析并鉴定其结合的相关转录因子,探讨长链非编码基因CCAT2的转录调控机制。方法以包含G/T位点为基准构建双荧光素酶报告基因质粒,分别命名为pGL3-153Gs-LUC、p GL3-153Ts-LUC和p GL3-837Gs-LUC和p GL3-837Ts-LUC;应用双荧光素酶报告基因方法,检测CCAT2启动子转录活性在低转移结肠癌KM12C细胞和高转移结肠癌KM12SM细胞中的差异,获得4种差异启动子区段,分别为G型153bp、T型153bp和G型837bp、T型837bp。选择最短效应区段,即长度为153bp的启动子区段,采用Pull-Down联合蛋白质质谱方法,筛选出与CCAT2基因启动子结合的候选转录因子,采用实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,q PCR)以及免疫印迹(Western-Blot)验证转录因子m RNA及蛋白差异表达;染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)结合q PCR以及微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR,dd PCR)检测转录因子在CCAT2基因启动子的结合活性。结果在KM12C细胞中,pGL3-Gs-LUC组、pGL3-Ts-LUC组G型与T型CCAT2启动子驱动的报告基因相对活性无差异;在KM12SM细胞中,两组比较,p GL3-153Gs-LUC和p GL3-153Ts-LUC差异有统计学意义(P0.05)。Pull-Down联合质谱结分析筛选出的差异蛋白分别为:ATP依赖的RNA解旋酶DDX17(Probable ATP-dependent RNA Helicase DDX17,DDX17)、波形蛋白(Vimentin)、重组结合蛋白抑制因子(Recombining Binding Protein Suppressor of Hairless,RBPJ)、ATP依赖的RNA解旋酶(Probable ATP-dependent RNA Helicase DDX5,DDX5)。应用q PCR检测差异基因的表达水平,结果显示,RBPJ和Vimentin在KM12系列细胞中低表达,而DDX5高表达,且DDX5基因在KM12SM细胞中的表达高于KM12C细胞;Western-Blot结果显示,在KM12SM中DDX5蛋白表达水平高于其在KM12C细胞中的表达;Ch IP结果显示DDX5与CCAT2基因启动子具有结合活性。dd PCR检测结果显示,在KM12SM中DDX5 G型等位基因结合活性高于T型等位基因。结论1 DDX5可能是CCAT2基因的转录调控因子。2在KM12SM细胞中,DDX5主要结合G型等位基因启动子。
【学位授予单位】:华北理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R730.2

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