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保加利亚乳杆菌ATCC 11842酸耐受机制关键基因的表达分析

赵云  
【摘要】:酸奶中的乳酸菌能将大分子蛋白质分解成人体易吸收的小分子营养物质,这对人体具有很重要保健功能,但酸奶严重的后酸化问题不仅严重影响风味,还大大缩短了酸奶的货架期,阻碍了我国酸奶行业发展。经无数学者的研究证明控制保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)在发酵后期的生长代谢是解决酸奶严重后酸化关键。乳酸菌需要克服生产、贮藏、运输过程中发酵介质的酸性环境,还要克服人体胃肠道的酸性环境(pH2.5-3.5)才可以到达小肠发挥益生作用[2-3]。保加利亚乳杆菌的耐酸能力在发酵酸奶、酸奶后酸化和发挥胃肠道益生功能中扮演着重要角色。保加利亚乳杆菌属于嗜酸乳杆菌菌群,其在世界范围内广泛应用于酸奶等发酵乳品生产,成为最具经济价值的同型发酵乳酸菌之一。Adolfsson O.和Shihata A.的研究中证明该菌种具有维持人体胃肠道菌群生态平衡、抑制肠道内病原菌滋长、和提高机体免疫力的益生功能。尽管对其进行了大量研究,但大多集中在其发酵性能和应用方面的研究,但是对此菌的代谢机制等方面研究甚少。本研究通过研究模式菌株保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在脱脂乳复原培养基中的基本生长特性和产酸特性,选取总RNA提取的时间,提取总RNA后进行半定量RT-PCR试验,其中以16S rDNA基因作为内参基因,对参与保加利亚乳杆菌ATCC11842菌株酸耐受机制的一些相关基因在不同生长时期的表达情况进行检测;根据半定量RT-PCR的结果,选取出在表达量上存在差异比较明显的基因进行进一步深入研究,以期能够探究出差异基因在酸奶后酸化过程中的相关机理。研究结果表明(1)模式菌株保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在脱脂乳中发酵11h到达发酵终点,发酵终点pH至为4.8、活菌数为2.3×108 CFU/mL;发酵结束后立即将发酵脱脂乳放到4℃贮藏,7d后测得pH值为4.6、活菌数1.5×108 CFU/mL。(2)选取4个不同时期提取总RNA,分别是发酵对数中后期(pH 5.3)、发酵终点(pH 4.8)、完成发酵后于4℃C冰箱降温2 h、4℃贮藏7d(pH 4.6)。通过电泳检测、紫外分光光度计检测和RT-PCR检测总RNA提取质量,确定质量合格。进行半定量RT-PCR试验,发现tpiA基因在在不同发酵时期的表达差异比较明显,在后酸化期表达量明显高于其他三个时期。(3)本研究针对这一基因进行深入研究:构建重组载体V1和V2,V1是由正向的tpiA基因和质粒pMG36e重组构成,V2是由反向的tpiA基因和质粒pMG36e重组构成。将质粒pMG36e和V1成功的转化到保加利亚乳杆菌ATCC 11842中,结果表明该基因过表达与对照菌株相比其pH变化一致,但是菌株在稳定期的OD值稍有下降,由此证明过量表达该基因对该菌株产酸没有太大影响。本研究为深入研究保加利亚乳杆菌的酸耐受机制调控网络提供更多有价值的信息,为开发具有自主知识产权的弱后酸化能力的酸奶发酵剂提供理论依据。


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