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《河北农业大学》 2018年
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猪肠道抗PEDV乳酸菌株筛选及其体外抗病毒作用

郑常龙  
【摘要】:乳酸菌在医药、农业及食品等行业发挥着重要的作用,其安全性已经受到认可。猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)对仔猪的致死率极高,对养猪业有极大的经济损失,PEDV的防治成为养猪行业的一大难题。为从仔猪粪便中分离得到抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的乳酸菌,本研究先用MRS培养基对乳酸菌进行了初步的分离与纯化,再将得到的乳酸菌通过MTT比色法、TCID_(50)法、间接免疫荧光法在体外细胞模型上对乳酸菌的抗病毒效果进行评价,从中得到3株抑制病毒的益生菌株。本试验为乳酸菌抗病毒作用的进一步研究奠定了基础。试验利用MRS培养基先从猪粪便中分离出36株具有益生菌特性的菌株。然后通过MTT比色法初步筛选出具有抗病毒作用的10株乳酸菌。对分离的10株乳酸菌进行体外的耐酸耐胆盐试验,从中选出6株作为备用菌种。对6株菌进行生化试验以及16S rDNA鉴定得出4株为植物乳杆菌,1株粪场球菌,1株戊糖片球菌,选其中三株菌进行进一步抗病毒试验。将分离鉴定的菌株进行体外的抗病毒试验。首先利用MTT法计算出3株菌的最大无毒剂量,以此为起点将其进行稀释成不同浓度进行试验。试验在体外Vero细胞上进行。乳酸菌或其代谢产物通过三种方式(先加入乳酸菌或代谢产物后加入病毒;乳酸菌或者代谢产物和病毒同时加入;先加入病毒再加入乳酸菌或代谢产物)来评估PEDV对细胞的抑制作用。结果表明三种方式中有着不同的抑制效果,活菌试验中,乳酸菌预先处理组抑制率较好,代谢产物试验中,同时接入代谢产物和病毒组对PEDV抑制效果要比其他两组抑制效果好。将PEDV与乳酸菌共培养,然后检测病毒的TCID_(50),结果显示通过乳酸菌处理后的TCID_(50)/100μL分别为10~(-3.76)、10~(-3.82)、10~(-3.15),与对照组未经过处理组病毒TCID_(50)/100μL(10~(-4.16))作对比,均有不同程度的降低,说明了乳酸菌对病毒的毒力具有显著的抑制作用。利用间接免疫荧光法检测乳酸菌处理细胞后再感染病毒的效果,同时设立病毒与空白对照。通过观察荧光的数量来判定乳酸菌的抑制作用。结果很明显,加入乳酸菌及其代谢产物的处理组荧光数量比病毒对照组均有不同程度的降低,说明乳酸菌和代谢产物对PEDV吸附细胞具有一定的阻断作用。综上所述,本试验从猪粪便中成功分离并筛选出3株具有抗PEDV作用的乳酸菌,它们的菌体及代谢产物可以降低病毒对细胞活力影响,阻断PEDV对细胞的感染。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.6

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