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《河北农业大学》 2018年
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趋化因子在猪流行性腹泻病毒感染中的作用

孙立旦  
【摘要】:猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪的一种急性、接触性肠道传染病,以腹泻、呕吐、脱水、急性肠炎为特征。近年来PEDV导致大批仔猪死亡,给养猪业造成了巨大经济损失,但目前对其感染免疫机制的了解尚不深入。趋化因子是募集白细胞至感染部位的一类低分子量蛋白质,其趋化作用是炎症发生过程中重要的起始步骤,也是机体天然免疫功能的一个重要方面。本研究围绕PEDV感染免疫选题,通过体内外试验,探索趋化因子在PEDV感染中的作用,旨在为深入阐明PEDV的感染免疫机制提供科学依据。将6头21日龄健康仔猪随机分为PEDV强毒株感染组和阴性对照组。感染组每头口服接种1.5×10~(6.6) TCID_(50)的PEDV;对照组接种等体积的细胞维持液。感染后3 d应用基因表达谱芯片技术和FQ-PCR检测回肠组织中趋化因子mRNA的表达量。结果表明,感染猪回肠组织中趋化因子MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13的mRNA表达水平显著上调(P0.05)。为了验证PEDV强毒株感染宿主细胞后趋化因子表达水平的变化,将IPEC-J2细胞分为HBQY2016强毒株感染组、CV777弱毒株感染组、LPS阳性对照组和阴性对照组。两个病毒感染组分别接种0.5 MOI的HBQY2016强毒株和CV777弱毒株,阳性对照组用10μg/mL的LPS刺激,阴性对照组加入等体积的维持液。感染后18~20 h收集细胞,两个病毒感染组的MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9和CXCL13 mRNA的表达水平显著上升(P0.05),细胞上清中MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13水平显著升高(P0.05)。为了进一步阐明趋化因子在PEDV感染中的作用,设计合成并筛选了分别对MCP-1、CXCL9、CXCL13具有较高抑制活性的siRNA,并将IPEC-J2细胞分为PEDV感染组(强/弱毒株)、siRNA干扰-(强/弱毒株)感染组、siRNA阴性(NC)-PEDV(强/弱毒株)感染对照组和阴性对照组。通过Transwell趋化试验和流式细胞术分析,与病毒感染组相比,MCP-1干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组细胞下室内CD14~+单核细胞的个数分别下降400个细胞(P0.05)和1152个细胞(P0.05);CXCL9干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组的CD3~+CD4~-CD8~-γδT、CD3~+CD4~-CD8~+Tc、CD3~+CD4~+CD8~-Th和CD3~+CD4~+CD8~+Tm细胞亚群分别平均下降677、258、718、207个细胞和2605、533、2729、949个细胞(P0.05);CXCL13干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组的CD19~+B细胞亚群分别平均下降279个细胞和164个细胞(P0.05)。上述实验证明,PEDV强毒株感染引起趋化因子(MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13)表达量显著上调。强/弱毒株诱导产生的MCP-1对CD14~+单核细胞,CXCL9对CD3~+CD4~-CD8~-γδT、CD3~+CD4~-CD8~+Tc、CD3~+CD4~+CD8~-Th和CD3~+CD4~+CD8~+Tm细胞亚群,CXCL13对CD19~+B细胞具有趋化作用。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S858.28

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