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《河北医科大学》 2013年
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紫草素对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用及其相关机制研究

王力娜  
【摘要】:缺血性脑血管病是临床常见病、多发病,具有致残率高、复发率高、恢复缓慢等特点。国际卫生组织统计在全球范围内平均每400个人中存在一个缺血性脑血管病患者;而在我国每年新发生的250万脑血管病患者中,大约有75%以上为缺血性脑血管病。缺血性脑血管病的死亡率仅次于心脏疾病,是人类主要的死亡原因之一,而在所有的缺血性脑血管病患者中约有30%患者由于溶栓治疗或栓子自发向远端推移出现血管再通,伴随着缺血再灌注损伤的发生。 缺血再灌注损伤是导致患者病情加重的重要原因,近年来随着现代免疫学和分子生物学的迅速发展,对于脑缺血再灌注损伤病理生理机制的研究已取得了重大进步,认为其病理生理机制存在损伤级联反应,主要包括炎症损害、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、凋亡、细胞内钙超载、自由基损伤等几种因素相互作用形成了复杂的调控网络,造成一系列病理级联反应,可直接或者间接导致神经细胞凋亡/死亡。在脑缺血后复杂的病理损伤机制中,炎症反应、氧化应激是脑缺血再灌注损伤的主要原因,是目前神经科学研究的热点,抗氧化应激、减轻炎症损伤成为治疗缺血性脑血管病的主要途径之一。 尽管已经有许多合成或天然物质的神经保护剂经过实验研究,证明具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用,但是由于动物与人类生理机制及耐受性等方面的差异以及脑缺血后级联反应的复杂性,单一阻断某一病理环节的药物可能难以奏效,多数神经保护剂未能在临床得到广泛应用,出现临床和理论的严重脱节,所以在目前的临床治疗中,理想的神经保护剂应该具备针对缺血再灌注损伤多个损伤环节发挥保护作用的特性。 紫草素(Shikonin)是存在于天然植物中的一种脂溶性萘醌类化合物,分子式为:C16H16O5,主要存在于紫草科植物紫草的根中,具有多种药理活性,研究表明紫草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗凋亡、抗病毒等生物学作用,并且毒副作用低,具有良好的临床应用潜力。 本研究选用雄性CD-1小鼠为研究对象,采用线栓法建立脑缺血再灌注模型,在此模型基础上对脑缺血后炎症反应代表性因子TLR4,P38MAPK,NF-κB,TNF-α,氧化应激代表性因子HO-1,Nrf2,PI3K,AKT和MMP-9,claudin-5为代表的血脑屏障损伤程度进行观察,测定大脑皮层梗塞灶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和丙二醛(Malondiadehyde,MDA)的含量。确定缺血后与炎症反应、氧化损伤的关系,通过选用萘醌类化合物紫草素进行干预,对干预前后梗死体积、脑含水量、神经功能缺损进行评估,观察紫草素对TLR4,P38MAPK,NF-κB,TNF-α,PI3K,AKT,HO-1,Nrf2,MMP-9及Claudin-5信号通路的作用,初步探讨其在缺血再灌注损伤后的脑保护作用机制,并应用PI3K特异性拮抗剂LY294002进行干预,观察上述各因子的变化,评价神经功能缺失、脑水肿和梗死体积情况。本研究分三部分,现将各部分内容叙述如下。 第一部分紫草素对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗氧化作用及其相关机制研究 目的:观察脑缺血再灌注损伤后梗死体积、脑含水量、神经功能缺损评分、PI3K、AKT、HO-1、Nrf2的表达变化以及SOD活性和MDA含量的变化,研究紫草素对脑缺血再灌注损伤所致的氧化应激反应的作用,探讨紫草素抗氧化应激作用的相关机制。 方法:选用成年雄性CD-1小鼠为研究对象,采用改良Longa线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。试验1:随机将CD-1小鼠分为2组:假手术组(Sham),手术组(MCAO):根据不同的时间点又分为3h、6h、24h、48h、72h五个亚组。试验2:随机将CD-1小鼠分为4组:假手术组(Sham)、手术组(Vehicle)、低剂量紫草素干预组(L-Shi)(10mg/Kg)、高剂量紫草素干预组(H-Shi)(25mg/Kg)。试验3:采用随机的方法分别将CD-1小鼠分为4组:假手术组(Sham)、溶剂对照组(Vehicle)、大剂量紫草素干预组(H-Shi)及紫草素+LY294002组(Shikonin+LY294002)。Sham组:假手术前以灌胃方式给予等量PBS+1%DMSO,每日一次,连续三天,Vehicle组:缺血再灌注前以灌胃方式给予等量PBS+1%DMSO,每日一次,连续三天,L-Shi组:缺血再灌注前以灌胃方式给予紫草素10mg/Kg,每日一次,连续三天,H-Shi组:缺血再灌注前以灌胃方式给予紫草素25mg/Kg,每日一次,连续三天,紫草素+LY294002组:缺血再灌注前以灌胃方式给予以灌胃方式给予紫草素25mg/Kg,每日一次,连续三天,并于术前15分钟脑室注射30μg LY-294002。各组取材前进行神经功能评分,干湿重法测定脑组织含水量,TTC染色评价脑梗死体积,检测超氧化物歧化酶(SOD)的活性,丙二醛(MDA)含量的变化情况,分别用免疫组化,Western-blotting和RT-qPCR的方法检测缺血脑组织中PI3K、AKT、HO-1、Nrf2蛋白和mRNA水平的变化。 结果:Sham组中未见小鼠神经功能缺损;Vehicle组在24h和72h神经功能缺损评分均较严重,L-Shi组在24h和72h与Vehicle组相比可降低神经功能缺损,但差异无统计学意义(P>0.05),H-Shi组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低神经功能缺损,结果有统计学差异(P<0.05);与Vehicle组相比,L-Shi组在24h和72h可降低脑含水量,但是差异无统计学意义(P>0.05),而H-Shi组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低脑含水量,差异有统计学意义(P<0.05);L-Shi组在24h和72h可减小脑梗死体积,但是差异无统计学意义(P>0.05),H-Shi组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低脑梗死体积,差异有统计学意义(P<0.05),但是H-Shi对神经功能缺损、脑水肿、脑梗死体积这种改善作用可被PI3K抑制剂LY294002阻断,差异有统计学意义(P<0.05)。 免疫组化结果显示,与Vehicle组相比,缺血后24h和72h,H-Shi组在24h和72h均可明显升高p-PI3K、p-AKT、HO-1、Nrf2的阳性细胞数,差异有统计学意义(P<0.05);L-Shi组在24h和72h可升高PI3K、AKT、HO-1、Nrf2的阳性细胞数,但是差异无统计学意义(P>0.05),H-Shi对PI3K、AKT、HO-1、Nrf2阳性细胞数的升高作用可被PI3K抑制剂LY294002阻断,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,H-Shi在24h和72h可明显升高p-PI3K、p-AKT、HO-1、Nrf2的蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05);L-Shi组在24h和72h可升高PI3K、AKT、HO-1、Nrf2的蛋白表达,但差异无统计学意义(P>0.05),H-Shi对PI3K、AKT、HO-1、Nrf2蛋白的升高作用可被PI3K抑制剂LY294002阻断,差异有统计学意义(P<0.05)。与免疫组化和Western blot结果一致,H-Shi在24h和72h可升高HO-1、Nrf2的mRNA表达,差异有统计学意义(P<0.05);L-Shi组在24h和72h可升高HO-1、Nrf2的mRNA表达,但差异无统计学意义(P>0.05)。与Vehicle组相比,H-Shi可明显增加SOD,减低MDA的含量,差异有统计学意义(P<0.05);L-Shi组可增加SOD,减低MDA的含量,但差异无统计学意义(P<0.05)。 结论:缺血小鼠脑组织中的HO-1水平出现动态表达的变化过程,紫草素可通过改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失,减轻脑水肿,减小脑梗死体积,诱导HO-1、Nrf2、p-PI3K及p-AKT的表达,使SOD含量明显增加,MDA含量明显减少,从而对局灶性缺血再灌注脑损伤小鼠发挥其神经保护作用,同时这种保护作用可被PI3K特异性拮抗剂LY294002阻断,因此我们推测紫草素的神经保护可能是通过PI3K/HO-1通路的激活实现其神经保护作用。 第二部分紫草素对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗炎作用及其相关机制研究 目的:观察脑缺血再灌注损伤后TLR4/MAPKs/NF-κB/TNF-α的表达变化,研究紫草素对脑缺血再灌注损伤所致的炎症反应的作用,并探讨紫草素抗炎相关作用机制。 方法:选用成年雄性CD-1小鼠为研究对象,应用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。试验1:将CD-1小鼠随机分为2组:假手术组(Sham),手术组(MCAO),根据不同的时间点又分为3h、6h、24h、48h、72h五个亚组。试验2:将CD-1小鼠随机分为4组:假手术组(Sham)、手术组(Vehicle)、低剂量紫草素干预组(L-Shi)(10mg/Kg)、高剂量紫草素干预组(H-Shi)(25mg/Kg)。Sham组:假手术前以灌胃方式给予等量PBS+1%DMSO,每日一次,连续三天,Vehicle组:缺血再灌注前以灌胃方式给予等量PBS+1%DMSO,每日一次,连续三天,L-Shi组:缺血再灌注前以灌胃方式给予紫草素10mg/Kg,每日一次,连续三天,H-Shi组:缺血再灌注前以灌胃方式给予紫草素25mg/Kg,每日一次,连续三天。各组取材前进行神经功能评分,分别用免疫组化,Western-blotting和RT-qPCR的方法检测缺血脑组织中TLR4,P38MAPK,NF-κB,TNF-αmRNA和蛋白水平的变化。 结果:在缺血再灌注早期TLR4、p-p38MAPK的表达呈逐渐增高的趋势,在24h达到高峰,可持续到48h,于72h逐渐开始下降。两种剂量紫草素干预后均可以使脑缺血再灌注后缺血脑组织炎症反应降低,TLR4/MAPKs/NF-κB/TNF-α mRNA表达下降。基因水平表达统计结果显示,H-Shi可明显减轻TLR4,p-p38MAPK,NF-κB,TNF-α表达,差异有统计学意义(P<0.05),而L-Shi组虽可减轻缺血后上调的TLR4,p-p38MAPK,NF-κB,TNF-α表达,但结果无统计学差异(P>0.05)。免疫组化和Western blot与基因水平表达统计结果一致。 结论:紫草素对缺血再灌注小鼠有较好的神经保护作用,可改善脑缺血损伤后的神经功能缺失,减轻脑水肿,减小脑梗死体积,同时缺血再灌注损伤后的脑组织的TLR4,p-p38MAPK,NF-κB,TNF-α的表达变化与脑组织损伤程度一致,提示脑缺血再灌注后TLR4/MAPKs/NF-κB通路的参与了缺血后损伤;紫草素可下调TLR4,p-p38MAPK,TNF-α,抑制NF-κB的核转位,从而减轻缺血后的过度炎症反应,实现缺血后的神经保护作用。 第三部分紫草素对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的血脑屏障保护作用及其相关机制研究 目的:观察脑缺血再灌注损伤后血脑屏障通透性变化,探讨紫草素对血脑屏障的保护作用及相关机制。 方法:选用成年雄性CD-1小鼠为研究对象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。试验1:随机将CD-1小鼠分为2组:假手术组(Sham)(n=30),手术组(MCAO),每组又根据不同的时间点分为3h、6h、24h、48h、72h五个亚组(n=90)。试验2:随机将CD-1小鼠分为4组:假手术组(Sham)、手术组(Vehicle)、小剂量紫草素组(L-Shi)(10mg/Kg)、大剂量紫草素组(H-Shi)(25mg/Kg)。Sham组:假手术前以灌胃方式给予等量PBS+1%DMSO,每日一次,连续三天,Vehicle组:缺血再灌注前以灌胃方式给予等量PBS+1%DMSO,每日一次,连续三天,L-Shi组:缺血再灌注前以灌胃方式给予紫草素10mg/Kg,每日一次,连续三天,H-Shi组:缺血再灌注前以灌胃方式给予紫草素25mg/Kg,每日一次,连续三天。各组取材前进行神经功能评分,血脑屏障通透性通过检测血管内皮细胞紧密连接蛋白成分Claudin-5进行评价。将各组小鼠分别于相应时间点进行神经功能评分后断头处死,采用免疫组化、western blot和qR-TPCR来观察脑缺血后Claudin-5以及MMP-9的mRNA和蛋白水平动态变化,通过Evans Blue的渗出情况评估血脑屏障的完整性。 结果:在缺血再灌注早期MMP-9表达升高(P<0.05),至24h达到高峰,可持续至72h,与正常组比较,差异有统计学意义;两种剂量紫草素干预后均可以上调脑缺血再灌注后小鼠的Claudin-5表达,同时使MMP-9表达减少,H-Shi可明显诱导Claudin-5表达增加,减少MMP-9表达,差异有统计学意义,L-Shi组可上调诱导Claudin-5表达增加,减少MMP-9,但差异无统计学意义(P>0.05)。Claudin-5、MMP-9mRNA表达以CT值表示,Sham组、Vehicle组、L-Shi组、H-Shi组Claudin-5的CT值分别为:Claudin-51.75±0.03,0.19±0.10,0.63±0.28,1.63±0.38;MMP-90.25±0.06,1.87±0.23,1.62±0.10,1.16±0.15。Claudin-5、MMP-9蛋白的表达变化与基因水平改变类似。再灌注24h后,Evans Blue染色的结果显示,与Vehicle组相比,H-Shi能够明显减少Evans Blue的渗出,维持血脑屏障的完整性。 结论:血脑屏障通透性显著增加是导致明显的神经功能缺失、脑水肿形成的直接原因。局灶性脑缺血再灌注后,缺血脑组织中Claudin-5、MMP-9表达的变化过程与脑组织损伤程度一致;紫草素通过抑制MMP-9、上调Claudin-5的表达,保护了血脑屏障的完整性,因此改善了脑缺血的神经功能缺失、脑水肿,减小了梗死体积。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R743;R965

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