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《河北医科大学》 2013年
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法舒地尔对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响及Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的作用

江金垚  
【摘要】:目的:近年来,随着血管内介入技术的不断发展以及支架技术的安全性和有效性逐渐提高,支架植入术已经成为冠状动脉及外周动脉狭窄的主要治疗方法,支架被广泛应用于各种动脉狭窄性疾病的介入治疗,不仅能够明显改善狭窄相关的症状及预后,还能预防缺血性事件的发生。但支架内再狭窄仍然是目前无法解决的难题,药物抑制支架内再狭窄并不能达到理想的效果,虽然药物涂层支架的使用能显著降低再狭窄的发生,但其远期再狭窄率与金属裸支架相比并无明显差别,晚期新生内膜增生仍然是支架内给药的潜在不良后果。血管平滑肌细胞过度增殖、迁移,以及细胞外基质积聚被认为是远期支架内再狭窄形成的主要原因。由于药物洗脱支架存在诸多限制,而且价格昂贵,因此给予支架植入患者有效的药物治疗方案来保持对新生内膜的长久抑制就显得非常有必要。 Rho激酶对血管平滑肌细胞(VSMC)的粘附,迁移,增殖,和胞质分裂起着至关重要的作用。Rho激酶参与血管紧张素Ⅱ(ANG Ⅱ),血小板衍生生长因子(PDGF),凝血酶,内皮素-1等分子的信号转导,而所有这些分子都被证实对再狭窄,尤其是支架内再狭窄的发病起着重要作用。另外,Rho激酶参与血管活性氧(ROS)生成。ROS又通过促进血管平滑肌细胞生长及刺激促炎事件等方式促进血管新生内膜形成,从而加速血管再狭窄的发生。越来越多的证据表明,Rho激酶可作为再狭窄治疗的新靶点。 众所周知,Ras-MEK1/2-ERK1/2通路对细胞增殖具有至关重要的作用,而PI-3K/AKT信号通路与细胞生存关系密切。本研究通过观察法舒地尔对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响并探讨其可能的分子生物学机制。以求进一步了解法舒地尔对血管再狭窄药理作用,并期望其能成为预防治疗动脉狭窄介入术后再狭窄的新型药物。 方法:提取培养SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞,待细胞生长至70%~80%汇合后换用无血清培养液饥饿培养24h,使细胞处于静止期,然后换用含10%FBS的培养液,分别加入不同浓度(1,10,100μmol/L)的法舒地尔孵育48h,收集细胞用于下列实验。实验共分为五组:A组:无血清组;B组:血清组;C组:血清+1μmol/L法舒地尔干预组;D组:血清+10μmol/L法舒地尔干预组;E组:血清+100μmol/L法舒地尔干预组。通过MTT法,BrdU法及划痕试验测定血管平滑肌细胞的增殖和迁移;应用流式细胞法测定血管平滑肌细胞周期及细胞凋亡;应用Western免疫印迹法测定Ras-MEK1/2-ERK1/2以及Akt蛋白通路的磷酸化水平。 结果:(1)法舒地尔以剂量依赖性方式抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移:MTT检测结果表明,法舒地尔可显著抑制体外培养的VSMC增殖,并具有明显的量效关系(P0.05)。在法舒地尔1,10,100μmol/L范围内,随着浓度的升高,VSMC的增殖活力逐渐下降,与对照组相比,分别下降2.04%,8.98%,30.39%(24h);6.17%,23.36%,59.82%(48h)。BrdU检测结果表明,法舒地尔可显著抑制体外培养的VSMC增殖,并具有明显的量效关系(P0.05)。在法舒地尔1,10,100μmol/L范围内,随着浓度的升高,VSMC的增殖活力逐渐下降,与血清组相比,分别下降9.94%39.36%49.37%(24h);7.38%,57.26%,70.74%(48h). (2)法舒地尔以剂量依赖性方式阻断细胞周期从G0/G1期过度到S期:分别用1、10、100μmol/L法舒地尔作用于VSMC24h, G0/G1期细胞逐渐增多(5.1%,14.2%,22.4%),S期细胞逐渐减少(3.9%,14.8%,19.1%),表明法舒地儿可抑制血管平滑肌细胞进入S期(P0.05)。 (3)法舒地尔以剂量依赖性方式抑制血管平滑肌细胞早期凋亡和晚期细胞凋亡:法舒地尔对细胞凋亡的影响通过流式细胞术测定,结果显示:1、10、100μmol/L法舒地尔作用VSMC48h,早期凋亡及晚期凋亡细胞逐渐增多,并随剂量的增加而递增。表明法舒地尔可促进血管平滑肌细胞凋亡(P0.05)。 (4)法舒地尔以剂量依赖性方式通过抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2通路起到其抗增殖效果:通过10%FBS刺激诱导Ras通路激活后加入法舒地尔,结果显示:Ras通路的表达明显减少,并呈现剂量依赖效应(P0.05)。作为Ras下游的激酶,我们也检测了磷酸化和非磷酸化的MEK1/2和ERK1/2的蛋白表达,结果显示:应用法舒地尔后,以剂量依赖的形式抑制了MEK1/2和ERK1/2通路的磷酸化表达(P0.05),另外,P13k-Akt通路也显示可以介导FBS诱导的血管平滑肌细胞的迁移和增殖,法舒地尔是否通过这一通路起作用在本研究中被调查,结果显示:FBS诱导了Akt的激活,但应用法舒地尔后没有发现其对Akt磷酸化的抑制效果(P0.05). 结论:法舒地尔通过对Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的抑制作用以及对细胞凋亡的促进作用实现对血管平滑肌细胞增殖的抑制。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R965

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