收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

G蛋白耦联受体激动剂调节细胞膜PIP_2代谢及生理学意义的研究

徐佳曦  
【摘要】:磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)是分布在细胞膜内侧面的一种微量磷脂,其含量约占细胞膜磷脂总量的1%。虽然含量很低,但PIP2在细胞信号转导、锚定骨架蛋白以及激活或稳定膜蛋白等方面却起着举足轻重的作用。因此在不同的组织器官中PIP2代谢水平的改变可能与疾病的发生有关。 PIP2是磷脂酰肌醇(PI)在肌醇环4位和5位磷酸化的产物。一方面,在细胞信号转导中它可以被激活的磷脂酶C(PLC)水解生成二脂酰甘油(DAG)和肌醇1,4,5-三磷酸(IP3);也可以被磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)磷酸化成为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3),后者是激活PI3K/Akt细胞生存通路的关键信号分子。另一方面,磷脂酰肌醇-4-激酶(PI4K)可以将细胞中的PI磷酸化成为磷脂酰肌醇-4-磷酸(PI4P),后者则会被细胞膜上的磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)磷酸化从而完成PIP2的合成。 除酪氨酸激酶通路外,PLC的激活一般是通过Gq蛋白耦联受体(GqPCR)介导的。儿茶酚胺类化合物、血管紧张素II等激素能够激活细胞膜上的GqPCR。激活的Gq蛋白的α亚基与βγ亚基分离,GTP水解释放的能量将PLC激活,后者完成PIP2的水解。在较短时间内PIP2通过水解局部的再合成机制来维持自身含量水平的稳定,在加大刺激强度并延长刺激时间的情况下细胞中PIP2的水平则可能发生改变。与短时刺激造成的局部影响不同,在增大作用浓度或延长刺激时间的情况下,G蛋白耦联受体激动剂能够增加成年大鼠心肌细胞或脑组织中PIP2的含量。许多重要的体内活性物质都是G蛋白耦联受体激动剂,这些活性物质往往在疾病状态下发生改变,因此在疾病的发生过程中相应细胞中PIP2的代谢状态也可能发生改变。所以,研究在这些情况下PIP2的代谢特征对于探究疾病的发生机制以及寻找可能的治疗方法十分有意义。本研究首先针对去甲肾上腺素和血管紧张素II对心肌PIP2代谢的影响及机制,以及这些作用与心肌肥厚、心脏功能之间的关系进行了研究;此外还研究了去甲肾上腺素和5-羟色胺对脑PIP2相关代谢机制的影响及其与抑郁症的相关性。研究结果表明,在激动剂刺激的过程中PIP2合成酶PI4K与PIP5K的活性发生变化是PIP2含量改变的原因;而且,这种PIP2含量的改变可能是细胞在激动剂刺激下为维持自身功能正常而做出的一种适应性改变。具体的研究内容如下: 第一部分去甲肾上腺素和血管紧张素II对大鼠心肌细胞膜PIP2以及心肌功能的调节 目的:早在上个世纪研究者们就发现了Gq蛋白耦联受体激动剂对细胞膜磷脂酰肌醇代谢的调节作用,然而对其中具体的调节机制和生理意义却仍不清楚。本部分实验对Gq蛋白耦联受体激动剂去甲肾上腺素(NE)、血管紧张素II(Ang II)调节大鼠心肌细胞膜PIP2代谢的分子机制进行深入研究,并初步探讨了PIP2代谢改变对心肌细胞功能的影响及其与心肌肥厚发展不同阶段的相关性。 方法:分离大鼠心室肌细胞,使用薄层色谱(TLC)和脂-蛋白交叠分析(Lipid-protein overlay assay, LPOA)的方法来分析NE、Ang II对心肌细胞PIP2含量的影响;以Gq/PLC通路相关信号分子特异性抑制剂—U73122(抑制PLC活性)和bisindolylmaleimide-1(Bis-1)(抑制PKC活性)预处理细胞,以PIP2合成酶抑制剂wortmannin、PIK93以及腺苷(adenosine)预处理细胞,再按照前面所述的方法分析NE、Ang II刺激后心肌细胞中PIP2的含量变化;利用免疫共沉淀的方法检测激动剂刺激后PIP2合成酶PI4K与蛋白激酶C(PKC)之间的相互作用;使用TLC的实验方法测定NE、Ang II刺激后心肌细胞PIP2水平变化的时程曲线,20分钟到72小时之间取4-5个时间点进行研究;按照PIP2变化时程曲线的时间点,使用细胞动缘探测系统检测NE、Ang II刺激后心肌细胞收缩功能的变化;建立大鼠游泳致心肌肥厚以及异丙肾上腺素(isoprenaline)注射致心肌肥厚的实验模型,使用LPOA的实验方法测定在生理性心肌肥厚以及病理性心肌肥厚的不同条件下大鼠心室肌中PIP2总含量。 结果:(1)原代心肌细胞培养24小时后,再以NE(5μM)刺激2小时,或以Ang II(3μM)刺激24小时,经测定发现刺激后心肌细胞中PIP2的含量明显增加,使用α受体抑制剂—prazosin(3μM)或AT1受体抑制剂—losartan(3μM)处理细胞能够拮抗NE或Ang II对PIP2含量的增加作用;(2)以U73122(0.8μM)、U73343(U73122的同形无效物)、Bis-1(2μM)以及wortmannin(10μM)预处理细胞20-30分钟,再以NE(5μM,2h)、Ang II(3μM,24h)刺激细胞,经测定发现U73122、Bis-1和wortmannin均能够抑制NE或Ang II对心肌细胞PIP2以及PIP含量的增加作用;(3)以III型PI4K的抑制剂—PIK93(250nM)或II型PI4K的抑制剂—adenosine(2μM)提前30分钟处理细胞,再给予NE(5μM,2h)、Ang II(3μM,24h)孵育,经测定发现只有PIK93对NE或Ang II引起的PIP2含量增加具有明显的抑制作用并且显著降低了细胞中PIP的水平。单独给予细胞PIK93或adenosine,PIK93对心肌细胞中PIP2以及PIP的含量均无明显影响,但adenosine则显著下调了细胞中PIP2以及PIP的含量水平;(4)NE(5μM)、Ang I(I3μM)以及PKC激动剂佛波酯(PMA,0.5μM)均能够增加PI4KIIIβ与PKCα之间、PI4KIIIβ与PKCβ之间的相互作用,而在心肌细胞中PI4KIIIα与PKCs之间并无明显的相互作用;(5)当刺激心肌细胞24小时以后,NE或Ang II对PIP2含量的增加作用随刺激时间的延长而逐渐降低,甚至可能逆转为降低作用。与此同时,对应时间点上心肌细胞的收缩功能也出现与PIP2含量类似的变化;(6)使用LPOA的方法测定两种心肌肥厚动物模型心脏中PIP2的含量,相比正常动物,游泳致心肌肥厚大鼠心脏中PIP2的含量水平并无较大改变,而Iso注射组大鼠心脏中PIP2的含量却显著减少。 结论:NE和Ang II激动Gq蛋白耦联受体,并通过受体激动后的下游信号通路水解PIP2,同时激活PIP2的再合成。PKC与PI4KIIIβ之间的相互作用是连接PIP2水解与再合成通路的分子基础。通过对心肌细胞收缩功能以及两种不同心肌肥厚模型的研究我们发现,在应激刺激下PIP2含量的增加可能与心肌肥厚初期心脏的代偿功能有关。 第二部分PIP5Kγ在G蛋白耦联受体调节大鼠心肌细胞膜PIP2中的作用 目的:了解磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)在去甲肾上腺素(NE)、血管紧张素II(Ang II)及异丙肾上腺素(Iso)等G蛋白耦联受体激动剂在调节心肌细胞PIP2代谢中的作用及细胞信号机制。 方法:利用western blot的方法检测PIP5Kγ的表达水平;使用TLC的实验方法测定心肌细胞中PIP2的含量水平,观察NE、Ang II及Iso对心肌细胞PIP2含量的影响;使用药理学手段了解上述激动剂影响心肌细胞中PIP5Kγ的表达以及PIP2的含量的信号机制;使用蛋白合成酶抑制剂放线菌酮(cycloheximide)处理细胞,通过测定激动剂刺激后心肌细胞PIP2含量的改变,并以此来分析激酶表达与PIP2合成之间的联系;利用免疫共沉淀的方法检测激动剂刺激后PIP2合成酶PIP5Kγ与其水解酶PLC之间的相互作用。 结果:(1)NE(5μM)、Ang II(3μM)、PMA(0.5μM)以及β受体激动剂isoprenaline(0.5μM)均能够增加心肌细胞中PIP5Kγ的表达量,但NE与Iso的增加作用要显著大于Ang II与PMA的作用;(2)使用propranolol(3μM)抑制β受体或使用H89(30μM)抑制Gs蛋白耦联受体信号通路下游效应分子PKA,均能够抑制激动剂对PIP5Kγ表达水平的上调作用,但prazosin和Bis-1却对此无效;(3)β受体拮抗剂propranolol预处理细胞30分钟能够抑制NE对PIP2的增加作用。与NE类似,Iso也能够增加心肌细胞中PIP2的含量,但对PIP的含量却无明显影响;(4)Cycloheximide不仅能够抑制NE引起的PIP5Kγ表达量的增加,也能够显著降低心肌细胞中PIP2的含量并抑制NE的作用;(5)NE(5μM)、Ang II(3μM),以及Iso(0.5μM)均能够增强PIP2合成酶PIP5Kγ与水解酶PLCγ之间的相互作用。 结论:NE、Iso激动Gs蛋白耦联受体,并通过提高PIP5Kγ的表达水平来增加细胞中PIP2的再合成。由于能够同时激活Gq/PLC/PKC与Gs/cAMP/PKA两条通路,NE引起的PIP2含量增加要明显快于Ang II的作用。 第三部分去甲肾上腺素和5-羟色胺对鼠脑PIP2代谢的调节以及与抑郁症的关系 目的:PIP2是突触囊泡释放以及回收过程中不可缺少的关键物质,它与突触可塑性之间存在关系,同时也可能影响突触间递质的释放。因此研究脑磷脂酰肌醇特别是PIP2的代谢对于了解疾病状态下如抑郁症的发病机制以及寻找新的治疗手段具有重要意义。去甲肾上腺素(NE)及5-羟色胺(5-HT)是重要的与抑郁症相关的单胺类神经递质。在本研究中我们将研究NE和5-HT对大鼠和小鼠脑PIP2代谢的影响,通过测定给药后PIP2合成酶PI4K表达水平以及突触中PIP2含量的变化,初步探究中脑PIP2代谢改变与抑郁症之间的联系。 方法:利用western blot的方法检测NE、5-HT孵育后鼠脑内PIP2合成酶—PI4K的表达水平;提取膜蛋白,观察NE、5-HT孵育后PKC在细胞膜中的表达情况;利用免疫共沉淀的方法检测NE、5-HT孵育后PI4K与PKC之间的相互作用是否发生变化;分离突触小体,利用LPOA的方法(ELISA试剂盒)测定其中PIP2的含量,并观察NE、5-HT孵育后PIP2水平是否发生改变;建立小鼠的慢性社交失败抑郁症模型,初步研究模拟精神疾病状态下鼠脑内PI4K的表达状况。 结果:(1)给予NE(10μM)、5-HT(30μM)17分钟后,大鼠中脑切片中总PI4KIIIβ以及膜PI4KIIIβ的表达水平均出现明显增高;(2)通过使用PKC阻断剂Bis-1(1.5μM)预处理中脑切片我们发现,NE、5-HT对PI4KIIIβ表达量的增加作用依赖于PKC的激活;(3)NE、5-HT能够增强大鼠中脑切片中PI4KIIIβ与PKCα以及PI4KIIIβ与PKCβ之间的相互作用并增加其中脑突触小体中PIP2的含量;(4)虽然对小鼠中脑区域PI4K和PKC在的相互作用并无明显影响,但NE、5-HT能够显著降低PI4K和PKC在小鼠前额叶皮层中的相互作用以及该区域突触小体中PIP2的水平;(5)社交失败模型小鼠脑内的PI4KIIIβ表达水平下调。 结论:NE和5-HT能够促进大鼠中脑PI4K、PIP5K的表达,增强大鼠中脑和前额皮层PI4K与PKC间的相互作用,升高大鼠中脑PIP2水平。相对于大鼠,NE和5-HT对小鼠有不同的作用:只降低前额皮层PI4K与PKC间的相互作用和PIP2水平,而没有其他上述对大鼠的作用。在小鼠社交失败抑郁模型中,小鼠中脑和前额皮层中PI4K的表达相对于对照小鼠均有降低。这些初步结果表明,与抑郁症相关的中枢单胺类神经递质可以影响以PIP2为代表的磷脂酰肌醇代谢通路,并可能以此影响抑郁症的发生。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 戴德成;;充液结构的非线性耦联振动问题——多频共振研究[J];固体力学学报;1987年01期
2 曾心传;A.S.Cakmak;;在摆动和移动耦联作用下结构物对周期性水平运动的反应[J];固体力学学报;1987年03期
3 钟南萍;;文摘[J];世界地震工程;1993年03期
4 朱永谊,翁智远,吴家龙;考虑液面晃动和液体可压缩影响时的柱水耦联振动[J];力学学报;1989年06期
5 黄争鸣;埋在土中的输液管道的耦联振动[J];应用力学学报;1991年02期
6 黄争鸣;论理想流体与线弹性结构的耦联振动[J];应用数学和力学;1992年10期
7 谭邦本;;解决有限元半分析法中耦联问题的一个有效方法[J];湖南大学学报;1986年04期
8 温德超;李群生;孙焕纯;韦树莲;俞中直;;在激励下储液罐提离的非线性耦联振动的实验研究[J];实验力学;1990年04期
9 王修信,程文瀼,宋贞网;高层楼群耦联消振理论及参数分析[J];世界地震工程;2000年01期
10 韩淼,王亮;考虑耦联影响的二次结构体系减震分析[J];世界地震工程;2005年01期
11 张蓬;余跃;王世强;;膜耦联的关键分子junctophilin[J];生理科学进展;2009年03期
12 Takehira Takayanagi;William C.Schnobrich;韩光民;;耦联墙系统的非线性分析[J];国外地震工程;1981年02期
13 王武久;;轴对称激励下力变厚度圆柱壳与液体的耦联振动[J];应用力学学报;1990年01期
14 蒋洪平,张相庭;高耸结构的耦联阵风响应[J];应用力学学报;1993年03期
15 Chang Chen;王德民;俞贤通;;子系统抗震分析的非耦联准则[J];国外地震工程;1981年05期
16 李宁;李忠献;谢礼立;;基于UKF的双轴耦联Bouc-Wen模型识别与应用[J];工程力学;2013年07期
17 何晓宇;李宏男;;偏心形式对偏心结构扭转耦联地震响应的影响[J];世界地震工程;2008年03期
18 P.Jehlicka;G Frik;G Platz;何度心;;HDR各部件去耦联分析的可能性[J];世界地震工程;1985年01期
19 顾宝洪;心室-血管耦联系统的压力与流量计算[J];云南大学学报(自然科学版);1998年03期
20 刘洪兵,朱晞;通用有限元分析程序中耦联弹簧的处理[J];解放军理工大学学报(自然科学版);2003年03期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 马红;李朝军;李春伶;刘卫星;;超声评价Ⅱ型糖尿病患者心脏-血管耦联[A];中国超声医学工程学会第十一届全国超声医学学术大会论文汇编[C];2012年
2 刘林;白国良;赵春莲;;空冷支架竖向混合结构平扭耦联地震反应分析[A];中国钢协钢-混凝土组合结构分会第十一次年会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 徐佳曦;G蛋白耦联受体激动剂调节细胞膜PIP_2代谢及生理学意义的研究[D];河北医科大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前6条
1 王璐璐;高压输电塔线体系风致耦联效应研究[D];郑州大学;2015年
2 张铁军;串联式主附结构体系耦联分析及隔震研究[D];中国海洋大学;2012年
3 陈亚东;应用超声技术研究2型糖尿病患者心脏—血管耦联[D];山西医科大学;2013年
4 钱占松;电液伺服马达压力耦联同步驱动技术研究[D];哈尔滨工业大学;2013年
5 张桂英;“酒精—沼气双发酵耦联”工艺影响因子探索与工艺优化[D];江南大学;2013年
6 杨海;基于胶体界面高效耦联原理制备柔强型粘合剂[D];浙江理工大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978