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丁苯酞通过抗凋亡作用而减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经损害

张瑶  
【摘要】:目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以髓鞘脱失、神经胶质细胞增生、轴索病变和进行性神经功能障碍为主要特点的常见的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病。该病病程反复,致残率高,加重家庭与社会负担。但是引起多发性硬化的确切的病因及其发病机制目前尚不清楚。目前认为是由于环境因素、遗传易感性、自身免疫异常、氧化应激反应等多种因素综合作用的结果。细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控,是一种由基因调节控制的细胞程序性死亡过程。目前大量研究已证明:线粒体是内源性细胞凋亡信号转导途径中起至关重要作用的细胞器,而线粒体的结构和功能障碍导致细胞凋亡,最终导致多发性硬化和EAE模型中髓鞘脱失、轴索和神经元的变性。丁苯酞(dl-3n-butlphalide,NBP)是人工合成的消旋体,2002年,中国国家食品药品监督管理局首次批准丁苯酞可以应用于中风患者。实验证明丁苯酞可以通过改善供血、保护血脑屏障、抗血栓形成、改善线粒体功能等途径发挥脑保护作用,目前广泛应用在治疗缺血性脑血管病方面,并已取得良好效果。但目前国内外对于丁苯酞对于多发性硬化是否具有治疗作用的研究很少,关于丁苯酞对多发性硬化线粒体结构和功能损伤以及对多发性硬化的细胞凋亡影响,尚未见报道。本研究通过观察对丁苯酞对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠神经细胞是否具有保护作用,从而为临床治疗多发性硬化提供新的方法。实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前国内外公认的多发性硬化研究的理想动物模型,是一种以中枢神经系统内小血管周围单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病。本实验以丁苯酞作为干预药物,通过观察实验动物神经功能评分及Tunel染色阳性细胞表达变化情况,探讨丁苯酞能否通过抗细胞凋亡作用而减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠神经损伤作用,为临床探索新的治疗方法提供理论依据。方法:1实验动物购买与饲养:选择健康C57BL/6雌性小鼠45只,周龄介于6-8周,体重在180~220g之间,购于北京维通利华实验动物技术有限公司。随机分笼,以标准饲料、自来水饲养于河北医科大学第二医院神经内科实验室实验动物中心,环境恒温20~25℃。2实验动物分组:将免疫发病后C57BL/6小鼠36只随机分为EAE组(E,生理盐水0.1ml/d/只)、地塞米松组(D,地塞米松注射液0.07mg/只)、丁苯酞低剂量组(L,丁苯酞80mg/d/只)及丁苯酞高剂量组(H,丁苯酞120mg/d/只)。另取9只正常小鼠为正常对照组(N,生理盐水0.1ml/d/只)。小鼠发病当天(0天),地塞米松组、丁苯酞低剂量组及高剂量组分别于发病后每日腹腔注射相应剂量药物。正常组及EAE组仅每日腹腔注射相应剂量的生理盐水,共14天。各组再以发病后0天、7天、14天分为三个亚组,每个亚组3只小鼠。3 EAE模型的建立:用生理盐水将抗原MOG35-55稀释成6mg/ml,并按1:1等体积加入完全弗氏佐剂(加入结核杆菌H37Ra使其终浓度为4mg/ml),混合乳化。充分乳化后将小鼠用乙醚麻醉,将小鼠充分固定后于小鼠背部脊柱两侧分四点皮下注射(每只0.1ml),第0h及第48h后腹腔注射0.5ml PTX。正常组小鼠不作上述处理。4实验小鼠神经功能评分:自免疫当天起每日早晚两次(间隔约8小时),由两名观察者同时对小鼠进行称重、神经功能评分。采用国际通用的Benson(5分)评分标准对实验小鼠进行神经功能评分:具体评分标准如下:0分无任何临床症状;1分小鼠尾部张力消失,不能上抬,步态可见轻度笨拙;2分小鼠双后肢均无力,被动翻身可恢复;3分小鼠双后肢瘫痪,被动翻身后,不能自行恢复,但是给予刺激后可以挪动;4分小鼠双后肢瘫痪,前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁;5分濒临死亡或死亡。评分时如果小鼠临床症状介于两个评分之间,则选取较低分数加0.5分来表示。5取材:于发病当天(0天):EAE组、正常对照组各取3只;发病第7天、14天:EAE组、丁苯酞低剂量组、丁苯酞高剂量组、地塞米松组各取3只;给予10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后,先以生理盐水心脏灌注(流出液无血液后),再以4%多聚甲醛经心脏灌注后,取脊髓腰膨大处组织常规石蜡包埋,制成石蜡切片,5μm连续切片。应用Tunel染色法测定凋亡阳性细胞数目变化情况。结果:1实验小鼠免疫后发病情况:小鼠在接受免疫后一周左右出现精神萎靡、皮毛不整、活动减少、体重下降等。免疫10天后左右小鼠开始发病,表现为尾部上抬无力,张力消失,肌张力下降,肢体瘫痪、部分出现四肢瘫等。2动物神经功能评分发病后第7天:L7、H7、D7组及E7组小鼠的神经功能评分分别为1.67±0.76、1.50±0.5、1.33±0.29、2.67±0.87,L7、H7及D7组小鼠评分均小于EAE组,差异有统计学意义(P0.05),L7、H7及D7组间评分无明显差异(P0.05)。发病后第14天:L14、H14、D14组及E14组小鼠的神经功能评分分别为1.17±0.58、1±0.5、1±0、2.17±0.29,L14、H14、D14组小鼠评分均小于EAE组,有统计学意义(P0.05),L14、H14及D14组间评分无明显差异(P0.05)。3 Tunel染色阳性细胞数:正常组小鼠脊髓几乎没有Tunel染色阳性细胞。实验组小鼠脊髓均有Tunel染色阳性细胞,散在分布于脊髓实质及小静脉周围。凋亡细胞可能为神经元、少突胶质细胞、炎性细胞等。E0组、E7组、E14组Tunel染色阳性细胞数分别为39.33±4.56、40.37±4.23、34.30±4.33,E14组小鼠Tunel染色阳性细胞数少于E0组及E7组,有统计学意义(P0.05),E0组与E7组Tunel染色阳性细胞数无明显差异(P0.05)。发病后第7天:L7、H7、D7组及E7组小鼠的Tunel染色阳性细胞数分别为23.53±4.92、21.53±3.49、22.67±4.06、40.37±4.23,L7、H7及D7组小鼠Tunel染色阳性细胞数均小于EAE组,有统计学意义(P0.05),L7、H7及D7组Tunel染色阳性细胞数无明显差异(P0.05)。发病后第14天:L14、H14、D14组及E14组小鼠的Tunel染色阳性细胞数分别为20.30±3.72、20.27±3.47、21.20±3.89、34.30±4.33,L14、H14、D14组小鼠Tunel染色阳性细胞数均小于EAE组,有统计学意义(P0.05),L14、H14及D14组Tunel染色阳性细胞数无明显差异(P0.05)。结论:本实验通过应用丁苯酞对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠进行干预,通过观察EAE小鼠神经功能评分和Tunel染色阳性细胞数,证实丁苯酞可以明显减低EAE模型小鼠神经功能损害,减少细胞凋亡,改善EAE模型小鼠神经功能缺失。为临床治疗多发性硬化提供了新的治疗思路和方向。


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